一種檢測外泌體的方法及體系技術

本發明專利技術公開了一種檢測外泌體的方法及體系，所述方法包括如下步驟：A.采集含有外泌體的生物樣本，去除細胞，得到外泌體分析液；對外泌體進行大小鑒定、計數；取外泌體，進行蛋白定量；B.用外泌體檢測體系，測定上述外泌體分析液中的外泌體含量；C.采用外泌體CEA檢測體系，測定上述外泌體分析液中的外泌體CEA含量，確定外泌體CEA陰性和外泌體CEA陽性的判斷標準；D.基于步驟C的檢測結果，將上述外泌體分析液中的外泌體區分為外泌體CEA陰性亞群和外泌體CEA陽性亞群；E.建立生物樣本的外泌體分布模型。本發明專利技術的外泌體檢測體系能夠用于腸癌的診斷和病程監測。

【技術實現步驟摘要】
一種檢測外泌體的方法及體系
本專利技術屬于生物檢測領域，具體地說，涉及一種檢測外泌體的方法及體系、尤其是一種檢測生物樣本中外泌體CEA的方法及體系。
技術介紹
《2015年中國腫瘤登記年報》中的數據顯示，2015年中國腫瘤發病數為4249,000例，平均每天就有12,000例新診斷的腫瘤患者，而結直腸癌均是男性與女性發病率最高的五大腫瘤之一。世界衛生組織(WHO)指出防治癌癥關鍵是“早發現、早診斷、早治療”。因此，采用有效的方法實現癌癥的早期診斷對于降低癌癥整體死亡率、提高患者生存期起重大作用。目前，臨床常用的腫瘤標志物癌胚抗原CEA在腸癌病人血清中的靈敏度僅為30％-50％，早期檢出率更低，只有約10％-20％，這樣的靈敏度及特異性都滿足不了臨床早診早治的需求。腸癌包括結腸癌和直腸癌的防治仍存在大量亟待解決的問題，關鍵是如何更早期發現、及時干預及如何提高檢測靈敏度。外泌體是一類大小介于30-150nm的細胞分泌的囊泡，存在于人各種體液中。外泌體在細胞間通訊、信號轉導、腫瘤進展等方面發揮作用，特別地，外泌體通過表面豐富的蛋白分子，在介導腫瘤微環境的形成中起重要作用。近年來研究表明，外泌體攜帶腫瘤遺傳信息(DNA、RNA、蛋白質)，是腫瘤標志物的重要來源之一。2015年，美國安德森癌癥中心在Nature上發表重要研究成果，報道胰腺癌細胞外泌體中包含有一種GPC1蛋白，這種蛋白有可能可以作為一種標志物用于非侵入性診斷和篩查處于適合手術治療階段的早期胰腺癌。外泌體腫瘤蛋白標志物相對于血清標志物檢測，主要兩個優勢：1.診斷準確性提高，靈敏度提高(尤其是在早期診斷中)；2.特異性提高。因此，檢測外泌體腫瘤標志物備受人們關注。癌胚抗原CEA是一種腫瘤(結直腸癌、肺癌等)上皮細胞過表達的一種膜糖蛋白，參與腫瘤的發生和進展。血清CEA是一個廣譜的腫瘤標志物，臨床上常用于結直腸癌、肺癌、胃癌等輔助診斷及病程監控，然而，血清中CEA的檢測靈敏度低，不能滿足臨床要求。至今，結直腸癌臨床檢測缺乏一種檢測靈敏度高、特異性好的方法。相關文獻報道，外泌體上存在CEA，但迄今為止，外泌體CEA與結腸癌、直腸癌的關系尚未見報道。
技術實現思路
為了更清晰地分析生物樣本比如血清中的外泌體CEA與結直腸癌之間的關系，為探討外泌體CEA作為結直腸癌診斷指標的可行性、研究生物樣本種類與外泌體大小和CEA含量之間的關系、并且為生物樣本種類與外泌體CEA之間關系的研究提供實驗設計基礎，進而探討外泌體CEA在結直腸癌診斷中的臨床意義，本專利技術采用新的定性和定量檢測技術并結合數理統計手段來建立生物樣本的外泌體分布模型。本專利技術的目的是通過以下技術方案實現的：一種檢測外泌體的方法，包括如下步驟：A.采集含有外泌體的生物樣本，去除細胞，得到外泌體分析液；對外泌體進行大小鑒定、計數；取一定數量的外泌體，進行蛋白定量。B.用外泌體檢測體系，測定上述外泌體分析液中的外泌體含量，所述外泌體檢測體系包含：偶聯有抗外泌體表面標志物CD9和/或CD63和/或CD81單克隆抗體的磁性微粒，酶標記抗CD9和/或CD63和/或CD81單克隆抗體，CD9和/或CD63和/或CD81標準品，化學發光底物液；C.采用外泌體CEA檢測體系，測定上述外泌體分析液中的外泌體CEA含量，確定外泌體CEA陰性和外泌體CEA陽性的判斷標準，所述外泌體CEA檢測體系包含：偶聯有抗外泌體表面標志物CD9和/或CD63和/或CD81單克隆抗體的磁性微粒，酶標記抗癌胚抗原CEA單克隆抗體，CEA蛋白標準品，所述CEA蛋白可以是CEA重組蛋白，化學發光底物液；D.基于步驟C的檢測結果，將上述外泌體分析液中的外泌體區分為表面不包含CEA蛋白的外泌體CEA陰性亞群和表面包含CEA蛋白的外泌體CEA陽性亞群，并且計算外泌體CEA陰性亞群和外泌體CEA陽性亞群的比例；E.基于步驟A至D的檢測結果，建立生物樣本的外泌體分布模型。上述生物樣本選自全血、血漿、血清、尿液、腦脊液、唾液、精液、或眼淚。優選地，所述生物樣本是血清。優選地，當生物樣本是血清時，檢測血清CEA，并且比較分析檢測外泌體CEA與血清CEA的靈敏度及特異性。其中血清CEA的檢測可采用常規技術手段進行檢測。由于血清CEA已經是一個廣譜的腫瘤標志物，并且在臨床上用于結直腸癌、肺癌、胃癌等輔助診斷及病程監控，如果血清CEA水平與血清中外泌體CEA水平之間存在特定關系比如線性關系，那么血清中外泌體CEA有潛力成為一種腫瘤標志物從而用于癌癥的診斷及病程監控。上述的方法中，步驟B和/或步驟C中的酶可以是常用于ELISA中的酶，選自過氧化物酶比如辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)、磷酸酯酶或熒光素酶等，比如是堿性磷酸酶。在上述方法的步驟C中，可以將外泌體分析液梯度稀釋，分析稀釋倍數與相應發光值關系，以便驗證檢測到的信號是否是CEA特異性信號。此外，在上述方法的步驟C中，可以將CEA重組蛋白加入到CEA陰性生物樣本中，驗證外泌體CEA檢測體系中的抗CEA單克隆抗體是否是僅與游離CEA重組蛋白發生交叉反應、但不與陰性生物樣本中其他蛋白發生交叉反應。這種情況下CEA重組蛋白可以作為外泌體CEA替代物或同工蛋白，從而用作外泌體CEA標準品。優選地，在上述方法的步驟B和/或步驟D中，采用磁性微粒捕獲外泌體后，采用添加有低濃度吐溫(比如0.05％Tween-20)的洗液(或稱洗滌液)洗滌磁性微粒，以便去除非特異性捕獲物。與上述方法相適應地，本專利技術的另一目的是提供一種用于檢測外泌體的試劑盒，其包括外泌體檢測體系和外泌體CEA檢測體系，其中外泌體檢測體系包含：偶聯有抗外泌體表面標志物CD9和/或CD63和/或CD81單克隆抗體或多克隆抗體的磁性微粒，酶標記抗CD9和/或CD63和/或CD81單克隆抗體，CD9和/或CD63和/或CD81標準品，化學發光底物液；外泌體CEA檢測體系包含：偶聯有抗外泌體表面標志物CD9和/或CD63和/或CD81單克隆抗體或多克隆抗體的磁性微粒，酶標記抗癌胚抗原CEA單克隆抗體，CEA蛋白標準品，所述CEA蛋白可以是CEA重組蛋白，化學發光底物液。上述的試劑盒中，外泌體檢測體系和外泌體CEA檢測體系中用于捕獲外泌體的捕獲抗體是單克隆抗體或多克隆抗體，更優選都是單克隆抗體，選自下組：抗CD9抗體，抗CD63抗體，抗CD81抗體；抗CD9和CD63抗體，抗CD9和CD81抗體，抗CD63和CD81抗體；抗CD9、CD63和CD81抗體。相對應地，外泌體檢測體系中酶標記的抗體是單克隆抗體，選自下組：抗CD9單克隆抗體，抗CD63單克隆抗體，抗CD81單克隆抗體；抗CD9和CD63單克隆抗體，抗CD9和CD81單克隆抗體，抗CD63和CD81單克隆抗體；抗CD9、CD63和CD81單克隆抗體。優選地，當捕獲抗體和酶標記的抗體是混合物時，兩種以上抗體之間的摩爾比為1：1。本專利技術的試劑盒可用于用于測定含有外泌體的生物樣本比如血清中的外泌體CEA。在一種優選的實施方式中，上述試劑盒中的外泌體檢測體系和外泌體CEA檢測體系還分別包括稀釋液和洗液。優選地，所述稀釋液比如是含0.1wt％BSA的PBS緩沖液；所述洗液比如為25倍的PBST。本專利技術設計的洗本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測外泌體的方法，包括如下步驟：A.采集含有外泌體的生物樣本，去除細胞，得到外泌體分析液；對外泌體進行大小鑒定、計數；取一定數量的外泌體，進行蛋白定量。B.用外泌體檢測體系，測定上述外泌體分析液中的外泌體含量，所述外泌體檢測體系包含：偶聯有抗外泌體表面標志物CD9和/或CD63和/或CD81單克隆抗體的磁性微粒，酶標記抗CD9和/或CD63和/或CD81單克隆抗體，CD9和/或CD63和/或CD81標準品，化學發光底物液；C.采用外泌體CEA檢測體系，測定上述外泌體分析液中的外泌體CEA含量，確定外泌體CEA陰性和外泌體CEA陽性的判斷標準，所述外泌體CEA檢測體系包含：偶聯有抗外泌體表面標志物CD9和/或CD63和/或CD81單克隆抗體的磁性微粒，酶標記抗癌胚抗原CEA單克隆抗體，CEA蛋白標準品，化學發光底物液；D.基于步驟C的檢測結果，將上述外泌體分析液中的外泌體區分為表面不包含CEA蛋白的外泌體CEA陰性亞群和表面包含CEA蛋白的外泌體CEA陽性亞群，并且計算外泌體CEA陰性亞群和外泌體CEA陽性亞群的比例；E.基于步驟A至D的檢測結果，建立生物樣本的外泌體分布模型。

【技術特征摘要】
1.一種檢測外泌體的方法，包括如下步驟：A.采集含有外泌體的生物樣本，去除細胞，得到外泌體分析液；對外泌體進行大小鑒定、計數；取一定數量的外泌體，進行蛋白定量。B.用外泌體檢測體系，測定上述外泌體分析液中的外泌體含量，所述外泌體檢測體系包含：偶聯有抗外泌體表面標志物CD9和/或CD63和/或CD81單克隆抗體的磁性微粒，酶標記抗CD9和/或CD63和/或CD81單克隆抗體，CD9和/或CD63和/或CD81標準品，化學發光底物液；C.采用外泌體CEA檢測體系，測定上述外泌體分析液中的外泌體CEA含量，確定外泌體CEA陰性和外泌體CEA陽性的判斷標準，所述外泌體CEA檢測體系包含：偶聯有抗外泌體表面標志物CD9和/或CD63和/或CD81單克隆抗體的磁性微粒，酶標記抗癌胚抗原CEA單克隆抗體，CEA蛋白標準品，化學發光底物液；D.基于步驟C的檢測結果，將上述外泌體分析液中的外泌體區分為表面不包含CEA蛋白的外泌體CEA陰性亞群和表面包含CEA蛋白的外泌體CEA陽性亞群，并且計算外泌體CEA陰性亞群和外泌體CEA陽性亞群的比例；E.基于步驟A至D的檢測結果，建立生物樣本的外泌體分布模型。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟B和/或步驟C中，所述酶選自辣根過氧化物酶HRP、堿性磷酸酶AP、磷酸酯酶或熒光素酶。3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟C中，將CEA重組蛋白加入到CEA陰性生物樣本中，驗證外泌體CE...

【專利技術屬性】
技術研發人員：周小進，何林富，王義，
申請(專利權)人：上海良潤生物醫藥科技有限公司，
類型：發明
國別省市：上海,31