一種抗鏈球菌溶血素O快速診斷試劑盒及其使用方法技術

本發明專利技術涉及一種抗鏈球菌溶血素O快速診斷試劑盒及其使用方法，該試劑盒包含樣本處理液、反應緩沖液、膠體金標記穩定液、標準品、清洗液。其中，所述的膠體金標記穩定液為含2～8％(w/v)三羥甲基甲胺基乙磺酸、0.02～0.1％(w/v)疊氮化鈉、0.1～0.2％(w/v)吐溫?20、2～6％(w/v)海藻酸鈉、1～2％(w/v)甘氨酸的膠體金標記鏈球菌溶血素O溶液。與常規的膠乳增強免疫比濁法比較，本發明專利技術提供的抗鏈球菌溶血素O試劑盒大大提高了檢測的特異性和靈敏度，最低檢測限可達到0.1ng/ml，且與干擾物質交叉反應小，具有較寬的檢測線性范圍，線性范圍可達0.1～500ng/ml，檢測結果可靠。

【技術實現步驟摘要】
一種抗鏈球菌溶血素O快速診斷試劑盒及其使用方法
本專利技術屬于醫學生物類免疫檢測試劑領域，具體涉及一種抗鏈球菌溶血素O快速診斷試劑盒及其使用方法。
技術介紹
鏈球菌溶血素O是A群溶血性鏈球菌的代謝產物，它是一種具有溶血活性的蛋白質，并且是一種強抗原物質。人感染溶血性鏈球菌2～3周后，即可產生抗鏈球菌溶血素O(ASO)。此種抗體的顯著遞增與急性風濕熱、急性腎小球腎炎、風濕性心臟病、風濕性關節炎或急性腎臟病變等密切相關，持續存在或水平下降則提示疾病為非活動期或恢復期，臨床動態監測ASO具有重要意義。目前常用的檢測ASO的方法有：1)點免疫結合法、2)溶血抑制法、3)膠乳凝集法、4)酶聯免疫法、5)膠乳增強免疫比濁法。其中，點免疫結合法以硝酸纖維素薄膜為固相載體，把鏈球菌溶血素O抗原點在硝酸纖維素薄膜上，未點抗原的部分用吐溫20封閉，固定在硝酸纖維素薄膜上的抗原與被檢測血清中的抗鏈球菌溶血素O抗體反應，然后再與過氧化物酶標記的馬抗人免疫球蛋白IgG反應，過氧化物酶的存在與否則用含有鹽酸聯苯胺和過氧化氫的底物檢測，陽性反應點上由于形成有色的沉淀而把硝酸纖維素薄膜染成藍褐色?？赏ㄟ^目測判斷反應結果，但該方法只能定性不能進行定量。溶血抑制法依據還原劑助溶血素O能溶解紅細胞的特性，通過觀察ASO中和溶血素O的溶血作用，定量檢測ASO，該方法較敏感，但操作繁瑣，試驗影響因素較多，結果重復性欠佳。膠乳凝集法依據被測血清中若有高滴度的ASO，在與ASO膠乳反應時會引起后者凝集，如預先用25結合單位/ml溶血素“O”中和后，不出現凝集者說明血清中ASO＜250單位，為陰性，仍出現凝集者說明血清中的ASO＞250單位，為陽性，但其靈敏度低，特異性差，假陽性率高，已遠不能滿足臨床診斷、治療及預后的需要。酶聯免疫法依據抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物顯色，用酶標儀測定吸光度，通過標準曲線計算樣品中抗鏈球菌溶血素O抗體的含量，但該方法重復性較差，精密度較低，且容易受到酶穩定性的影響。膠乳增強免疫比濁法可定量測定血清中ASO含量，是當前國內外檢測ASO常用的手段，該方法以大小均一且表面包被有鏈球菌溶血素O的聚苯乙烯乳膠顆粒懸液為檢測試劑，當含有ASO的樣品與該試劑混合時，發生明顯的抗原-抗體凝集反應，通過測定570nm處吸光度值的變化，計算出樣品中ASO抗體的含量。如公開號為CN104483492A的中國專利申請公開了一種抗鏈球菌溶血素O抗體的檢測試劑盒，該試劑盒首先利用化學交聯法將惰性蛋白(牛血清白蛋白)與鏈球菌溶血素O結合，制得穩定性好的組合蛋白，再利用化學交聯法將組合蛋白與膠乳顆粒進行交聯，制成鏈球菌溶血素O-牛血清白蛋白-膠乳顆粒復合物，通過檢測抗原抗體之間的免疫反應形成的濁度，定量檢測ASO的含量。采用膠乳增強免疫比濁法對ASO進行檢測，具有重復性好，自動化程度高，操作簡便快速，但其檢測的靈敏度和檢測特異性有待提高。
技術實現思路
為解決現有技術存在的問題，本專利技術的目的在于提供一種抗鏈球菌溶血素O快速診斷試劑盒，采用該試劑盒進行抗鏈球菌溶血素O檢測具有較高的靈敏度和特異性，且操作簡單，操作流程短。本專利技術另外一個目的在于提供一種所述抗鏈球菌溶血素O快速診斷試劑盒的使用方法。本專利技術的上述目的是通過以下技術方案實現的：本專利技術提供了一種抗鏈球菌溶血素O快速診斷試劑盒，其包含樣本處理液、反應緩沖液、膠體金標記穩定液、標準品、清洗液。其中，所述的膠體金標記穩定液為含2～8％(w/v)三羥甲基甲胺基乙磺酸、0.02～0.1％(w/v)疊氮化鈉、0.1～0.2％(w/v)吐溫-20、2～6％(w/v)海藻酸鈉、1～2％(w/v)甘氨酸的膠體金標記鏈球菌溶血素O溶液。進一步地，所述的膠體金標記鏈球菌溶血素O溶液的制備包括以下步驟：(1)膠體金的制備：①取100mL質量濃度為0.01％的四氯金酸水溶液與1mL聚乙二醇4000混合，加熱至沸騰，保持沸騰3min，在1000r/min攪拌速度下，迅速加入2mL還原劑溶液，在攪拌下繼續加熱，直至溶液變成成橘紅色為止，冷卻，即得膠體金溶液；②取20mL含25mmol/LEDTA，質量分數為75％的蔗糖溶液置于50mL的離心管中，然后加入10mL含25mmol/LEDTA，質量分數為50％的蔗糖溶液，靜置10min，然后取10mL步驟①制得的膠體金溶液緩慢加入到離心管中，平衡后在4℃，2000r/min離心15～20min，收集處于75％的蔗糖與50％的蔗糖界面中的膠體金，即得；(2)膠體金標記鏈球菌溶血素O溶液的制備：①鏈球菌溶血素O用量確定：取1mL步驟(1)制得的膠體金，使用0.1mol/L的醋酸溶液調節pH至7.5～8.5，加入0.1mL10％的氯化鈉溶液，混勻，然后加入不同體積的鏈球菌溶血素O溶液，混勻，靜置1h，觀察是否有顏色改變或沉淀析出，當出現由紅變藍的聚沉現象，表明加入的鏈球菌溶血素O的用量不足，當無顏色改變且無沉淀析出，表明加入的鏈球菌溶血素O的用量為制備膠體金標記鏈球菌溶血素O溶液所需的鏈球菌溶血素O穩定用量；②膠體金標記鏈球菌溶血素O溶液的制備：取10mL步驟(1)制得的膠體金，使用0.1mol/L的醋酸溶液調節pH至7.5～8.5，加入1mL10％的氯化鈉溶液，加入10倍步驟①確定的制備膠體金標記鏈球菌溶血素O溶液所需的鏈球菌溶血素O穩定用量，混勻，反應10min，然后將反應液使用SephadexG-200柱進行純化，即得膠體金標記鏈球菌溶血素O溶液。上述述步驟(1)膠體金的制備中還原劑溶液的制備為：取10mL質量濃度為1％的抗壞血酸、6mL質量濃度為1％的鞣酸、1mL0.2mol/L碳酸氫鉀溶液和2mL雙蒸水，混合，即得。上述使用SephadexG-200柱對反應液進行純化的可以采用本領域常用的技術條件：如采用常規的層析柱，使用蠕動泵將反應液鋪加于凝膠床上，使用0.02MTris-HCl緩沖液，以1mL/10min的流速進行洗脫。采用蔗糖密度梯度對制得的膠體金進行篩選，使膠體金顆粒更為均勻，接近均相體系，然后將鏈球菌溶血素O抗原結合在大小均一的膠體金表面上，大大增加了試劑盒檢測的靈敏度和穩定性。進一步地，所述的反應緩沖液組成為：4～12％(w/v)2-(N-嗎啡啉)乙磺酸、2～4％(w/v)BSA、0.1～0.2％(w/v)吐溫-20、0.01～0.1％(w/v)疊氮化鈉、1～2％(w/v)乙二醇和2～8％(w/v)PEG6000。進一步地，所述的清洗液組為含0.1％(w/v)吐溫-20、0.1mol/L氯化鈉，且濃度為0.05mol/L、pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液。此外，本專利技術還提供一種樣本處理液的配方，經所述樣本處理液對待測血清進行處理，可降低血清中其他蛋白質的干擾，提高檢測靈敏度，使檢測結果更為可靠。所述的樣本處理液為含有0.05～0.1％(w/v)乙二胺四乙酸鈉、0.5～1％(v/v)TritonX-100、0.05～0.1％(w/v)Proclin300、且濃度為0.05mol/L、pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液。所述的抗鏈球菌溶血素O快速診斷試劑盒還包含一系列不同濃度的標準品，所述的標準品制備為：使用含0.1mol/L氯化鈉、2％(w/v)B本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種抗鏈球菌溶血素O快速診斷試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包含樣本處理液、反應緩沖液、膠體金標記穩定液、標準品、清洗液。

【技術特征摘要】
1.一種抗鏈球菌溶血素O快速診斷試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包含樣本處理液、反應緩沖液、膠體金標記穩定液、標準品、清洗液。2.根據權利要求1所述的抗鏈球菌溶血素O快速診斷試劑盒，其特征在于，所述的膠體金標記穩定液為含2～8％(w/v)三羥甲基甲胺基乙磺酸、0.02～0.1％(w/v)疊氮化鈉、0.1～0.2％(w/v)吐溫-20、2～6％(w/v)海藻酸鈉、1～2％(w/v)甘氨酸的膠體金標記鏈球菌溶血素O溶液。3.根據權利要求2所述的抗鏈球菌溶血素O快速診斷試劑盒，其特征在于，所述的膠體金標記鏈球菌溶血素O溶液的制備包括以下步驟：(1)膠體金的制備：①取100mL質量濃度為0.01％的四氯金酸水溶液與1mL聚乙二醇4000混合，加熱至沸騰，保持沸騰3min，在1000r/min攪拌速度下，迅速加入2mL還原劑溶液，在攪拌下繼續加熱，直至溶液變成成橘紅色為止，冷卻，即得膠體金溶液；②取20mL含25mmol/LEDTA，質量分數為75％的蔗糖溶液置于50mL的離心管中，然后加入10mL含25mmol/LEDTA，質量分數為50％的蔗糖溶液，靜置10min，然后取10mL步驟①制得的膠體金溶液緩慢加入到離心管中，平衡后在4℃，2000r/min離心15～20min，收集處于75％的蔗糖與50％的蔗糖界面中的膠體金，即得；(2)膠體金標記鏈球菌溶血素O溶液的制備：①鏈球菌溶血素O用量確定：取1mL步驟(1)制得的膠體金，使用0.1mol/L的醋酸溶液調節pH至7.5～8.5，加入0.1mL10％的氯化鈉溶液，混勻，然后加入不同體積的鏈球菌溶血素O溶液，混勻，靜置1h，觀察是否有顏色改變或沉淀析出，當出現由紅變藍的聚沉現象，表明加入的鏈球菌溶血素O的用量不足，當無顏色改變且無沉淀析出，表明加入的鏈球菌溶血素O的用量為制備膠體金標記鏈球菌溶血素O溶液所需的鏈球菌溶血素O穩定用量；②膠體金標記鏈球菌溶血素O溶液的制備：取10mL步驟(1)制得的膠體金，使用0.1mol/L的醋酸溶液調節pH至7.5～8.5，加入1mL10％的氯化鈉溶液，加入10倍步驟①確定的制備膠體金標記鏈球菌溶血素O溶液所需的鏈球菌溶血素O穩定用量，混勻，反應10min，然后將反應液使用S...

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳立國，鄒偉權，張亞麗，李慶祥，母潤紅，王濤，蘇焱，
申請(專利權)人：廣州華弘生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東,44