一種核苷酸基金屬仿生漆酶制造技術

本發明專利技術涉及一種核苷酸基金屬仿生漆酶，具體涉及一種用于酚類物質和腎上腺素類化合物檢測的核苷酸基金屬仿生漆酶，該金屬仿生漆酶為Cu

A novel biomimetic laccase based on nucleotides

The invention relates to a nucleotide based metal biomimetic laccase, in particular to a nucleotide based metal biomimetic laccase used for detection of phenols and epinephrine compounds. The metal biomimetic laccase is Cu

【技術實現步驟摘要】
一種核苷酸基金屬仿生漆酶
本專利技術涉及一種核苷酸基金屬仿生漆酶，具體涉及一種用于酚類物質和腎上腺素類化合物檢測的核苷酸基金屬仿生漆酶。
技術介紹
漆酶(苯二酚氧化酶，EC1.10.3.2)是一類含銅多酚氧化酶，可催化氧化多種酚類和非酚類的底物，如苯酚、氯酚、鄰苯二胺等。漆酶作為一種綠色、環保生物催化劑，催化氧化的底物十分廣泛，在廢水處理、生物漂白、芳香化合物轉化、生物傳感器構建等方面領域有廣泛的應用前景。但是，天然漆酶不僅價格昂貴，穩定性差，活性在使用過程中易受環境條件變化影響，另外酶無法回收進行重復使用，從而限制了天然漆酶在實際生活中的應用。因此，需要一種具有高穩定性和可循環利用的模擬酶來克服天然酶在應用過程中的諸多問題。隨著工業的發展，在改善人類生活的同時，也對環境帶來巨大的的危害。環境中的酚污染主要指酚類化合物對水體的污染，酚類化合物是指苯及其稠環的羥基衍生物。含酚廢水是當今世界上危害大、污染范圍廣的工業廢水之一，是環境中水污染的重要來源。目前，我國測定工業廢水中揮發酚的標準方法是以K3(Fe(CN)6)作氧化劑，4-氨基安替吡啉作顯色劑的紫外分光光度法，但是該法所生成的絡合物在水溶液中很不穩定，而且氧化劑對人體有毒害，因此需要一種新的氧化劑取代K3(Fe(CN)6)作氧化劑，應用于水體的酚類物質檢測。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種核苷酸基金屬仿生漆酶，以解決上述問題。本專利技術的實施例提供了一種核苷酸基金屬仿生漆酶，為Cu2+與核苷酸形成的納米網狀配位復合物，復合物以Cu2+為催化中心，以核苷酸為有機骨架，具有類漆酶活性。進一步，該核苷酸基金屬仿生漆酶用于檢測酚類化合物，酚類化合物包括苯酚、鄰苯二酚、對苯二酚、萘酚和2,4-二氯苯酚。進一步，檢測酚類化合物的方法包括:將核苷酸基金屬仿生漆酶與顯色劑4-氨基安替吡啉和酚類化合物的混合溶液反應30-120min，溶液反應后離心，上清液在510nm下測定吸光度。進一步，核苷酸基金屬仿生漆酶的濃度為0.025-0.5mg/ml,混合溶液中酚類化合物的濃度為0.005-0.1mg/mL，混合溶液中顯色劑4-氨基安替吡啉的濃度為0.1-0.5mg/mL，混合溶液的pH為2-10，混合溶液的鹽濃度為0-1000mmol/L。進一步，該鹽包括NaCl,KCl,CaCl2,MgCl2。進一步，該核苷酸基金屬仿生漆酶還用于檢測腎上腺素類化合物，腎上腺素類化合物包括腎上腺素和去甲腎上腺素。進一步，檢測腎上腺素類化合物的方法包括:將核苷酸基金屬仿生漆酶與腎上腺素類化合物和緩沖液混合反應15-120min，溶液反應后離心，在485nm下測定上清液的吸光度。進一步，核苷酸基金屬仿生漆酶的濃度為0.025-0.5mg/ml,腎上腺素類化合物的濃度為0.005-0.1mg/mL，緩沖液為MES緩沖液，緩沖液的濃度為30-100mmol/L，緩沖液的pH為6.8-7.4。進一步，該復合物的制備方法包括如下步驟：1)分別配制可溶性銅鹽和可溶性核苷酸溶液；其中，可溶性銅鹽的濃度為50-250mmol/L，可溶性核苷酸溶液的濃度為5-25mmol/L；可溶性核苷酸為5’-鳥嘌呤核苷單磷酸二鈉鹽及其二磷酸和三磷酸鈉鹽(GMP、GDP、GTP)、5’-腺嘌呤核苷單磷酸二鈉鹽及其二磷酸和三磷酸鈉鹽(AMP、ADP、ATP)、5’-胞嘧啶核苷單磷酸二鈉鹽及其二磷酸和三磷酸鈉鹽或鳥嘌呤核苷(CMP、CDP、CTP；2)將步驟1)配制的可溶性銅鹽和可溶性核苷酸溶液在常溫下混合，靜置0.5-3h，離心得到藍色沉淀，即核苷酸基金屬仿生漆酶；其中，離心轉速為10000-12000rpm，時間為5-10min。進一步，配制可溶性核苷酸溶液所采用的溶劑為水溶液、HEPES緩沖液或MES緩沖液；HEPES緩沖液的濃度為10mmol/L，pH為6.8-8.0；MES緩沖液的濃度為30mmol/L，pH為5.5-6.8。與現有技術相比本專利技術的有益效果是：該金屬仿生漆酶具有較高活性，能夠多次重復利用，并且穩定性大大優于生物漆酶，能夠代替生物漆酶應用于酚胺類物質的檢測，還能夠直接催化氧化腎上腺素類化合物生成顯色物質，從而實現對腎上腺素類化合物的檢測，檢測方法簡便易行且靈敏度較高。附圖說明圖1為本專利技術實施例1和實施例2制備的含銅核酸基金屬仿生漆酶的結構示意圖；圖2為本專利技術實施例3核苷酸基金屬仿生漆酶檢測酚類底物反應的紫外吸收光譜圖；圖3為本專利技術實施例4核苷酸基金屬仿生漆酶和天然漆酶在pH3.0、9.0檢測2,4-二氯苯酚的活性比較圖；圖4為本專利技術實施例5核苷酸基金屬仿生漆酶和天然漆酶在40℃和90℃檢測2,4-二氯苯酚的活性比較圖；圖5為本專利技術實施例6核苷酸基金屬仿生漆酶和天然漆酶在不同鹽溶度檢測2,4-二氯苯酚的活性比較圖；圖6為本專利技術實施例7核苷酸基金屬仿生漆酶和天然漆酶在9天后檢測2,4-二氯苯酚的活性比較圖；圖7為本專利技術實施例8不同濃度2,4-二氯苯酚與吸光度的線性回歸曲線圖；圖8為本專利技術實施例9不同濃度腎上腺素與吸光度的線性回歸曲線圖。具體實施方式下面結合附圖所示的各實施方式對本專利技術進行詳細說明，但應當說明的是，這些實施方式并非對本專利技術的限制，本領域普通技術人員根據這些實施方式所作的功能、方法、或者結構上的等效變換或替代，均屬于本專利技術的保護范圍之內。本實施例的第一目的在于提供一種水體中酚類物質的檢測方法，以克服現有工業廢水中揮發酚的標準測定方法的缺點。所述方法可應用于多種酚類物質的檢測，靈敏度高，穩定性好，在極端環境下仍能保持較高活性。本專利技術的第二目的在于提供一種檢測腎上腺素的方法。所述方法簡單方便，無需加入顯色劑，環保經濟，具有較低檢測限。為達到上述兩個目的，首先需要制備一種核苷酸基金屬仿生漆酶，通過游離銅離子溶液與核苷酸形成沉淀物，即得到金屬有機仿生酶。本方法原料易得，成本較低而且操作簡單方便。本實施例制備的核苷酸基金屬仿生漆酶是一種核苷酸-金屬配位聚合物。該核苷酸基金屬仿生漆酶對漆酶底物酚類物質具有催化氧化活性，表現出類似于漆酶的活性特征，因此可作為漆酶替代物，主要應用于水體的酚類物質檢測。檢測酚類物質的方法，是通過核苷酸基模擬酶催化漆酶酚類底物水溶液與在顯色劑聚合產生有色物質，在510nm處由紫外吸收，從而實現對漆酶底物的檢測。腎上腺素屬兒茶酚胺類神經遞質，在中樞神經內分布很廣，與人體神經系統應急能力密切相關，對其的檢測在臨床和基礎研究中非常重要。本實施例將制備的核苷酸基金屬仿生漆酶取代漆酶，應用于腎上腺素類化合物的檢測，檢測腎上腺素的方法，是利用核苷酸基金屬仿生漆酶直接催化氧化腎上腺素類化合物并生成褐色的顯色產物，在485nm處有紫外吸收，從而實現對腎上腺素類化合物的檢測。該檢測方法，其靈敏度高，重復性好，而且操作方便。下面通過具體的實施例對本專利技術作進一步說明。參圖1所示，圖1為本專利技術實施例1和實施例2制備的含銅核酸基金屬仿生漆酶的結構示意圖。實施例1一種核苷酸基金屬仿生漆酶的制備，包括以下步驟：1)分別配制氯化銅和5’-鳥嘌呤核苷單磷酸二鈉鹽水溶液，其中氯化銅濃度為50mmol/L，5’-鳥嘌呤核苷單磷酸二鈉鹽水溶液濃度為6mmol/L。2)取900μL步驟1)配制的5’-鳥嘌呤核本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種核苷酸基金屬仿生漆酶，其特征在于，為Cu

【技術特征摘要】
1.一種核苷酸基金屬仿生漆酶，其特征在于，為Cu2+與核苷酸形成的納米網狀配位復合物，所述復合物以Cu2+為催化中心，以核苷酸為有機骨架，具有類漆酶活性。2.根據權利要求1所述的一種核苷酸基金屬仿生漆酶，其特征在于，用于檢測酚類化合物，所述酚類化合物包括苯酚、鄰苯二酚、對苯二酚、萘酚和2,4-二氯苯酚。3.根據權利要求2所述的一種核苷酸基金屬仿生漆酶，其特征在于，所述檢測酚類化合物的方法包括:將所述核苷酸基金屬仿生漆酶與顯色劑4-氨基安替吡啉和酚類化合物的混合溶液反應30-120min，溶液反應后離心，上清液在510nm下測定吸光度。4.根據權利要求3所述的一種核苷酸基金屬仿生漆酶，其特征在于，所述核苷酸基金屬仿生漆酶的濃度為0.025-0.5mg/ml,所述混合溶液中酚類化合物的濃度為0.005-0.1mg/mL，所述混合溶液中顯色劑4-氨基安替吡啉的濃度為0.1-0.5mg/mL，所述混合溶液的pH為2-10，所述混合溶液的鹽濃度為0-1000mmol/L。5.根據權利要求4所述的一種核苷酸基金屬仿生漆酶，其特征在于，所述鹽包括NaCl,KCl,CaCl2,MgCl2。6.根據權利要求1所述的一種核苷酸基金屬仿生漆酶，其特征在于，還用于檢測腎上腺素類化合物，所述腎上腺素類化合物包括腎上腺素和去甲腎上腺素。7.根據權利要求6所述的一種核苷酸基金屬仿生漆酶，其特征在于，所述檢測腎上腺素類化合物的方法包括:將所述核苷酸基金屬仿生漆酶與腎上腺素類化合物和緩沖液混合反應15-1...

【專利技術屬性】
技術研發人員：梁浩，林菲菲，袁其朋，張育眉，張斯琪，
申請(專利權)人：北京化工大學，
類型：發明
國別省市：北京,11