一種分泌抗孔雀石綠單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一種分泌抗孔雀石綠單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用，屬于生物技術領域。所述雜交瘤細胞株命名為雜交瘤細胞株MG?A7，保藏編號為CCTCC?NO:C201666。本發明專利技術以羧基隱性孔雀石綠與牛血清白蛋白形成的偶聯物為抗原，免疫BALB/c小鼠，再將免疫后的小鼠的脾臟細胞與復壯的SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，并采用不添加抗菌素的培養基進行細胞培養，經多次篩選和克隆獲得雜交瘤細胞株；該雜交瘤細胞株分泌IgM?k鏈單克隆抗體靈敏度高，特異性強，可用于孔雀石綠的快速、準確免疫檢測和免疫分析。

【技術實現步驟摘要】
一種分泌抗孔雀石綠單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用
本專利技術涉及生物
，尤其涉及一種分泌抗孔雀石綠單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用。
技術介紹
孔雀石綠(MalachiteGreenoxalate，MG)是有毒的三苯甲烷類化學物，既是染料，也是殺真菌、細菌及寄生蟲的藥物。由于這類藥物高效、價格低廉，所以多年來被廣泛應用于水產養殖領域，用于預防和治療疾病。研究發現，孔雀石綠進入水生動物體內后，會快速代謝為脂溶性的隱性孔雀石綠(LMG)，隱形孔雀石綠由于其特性，能長期積蓄在機體組織內，殘留毒性強；在哺乳動物體內，孔雀石綠會引起細胞轉化和脂質過氧化，進而威脅人體健康，引發腫瘤。鑒于孔雀石綠具有潛在的致癌、致畸、致突變等危害性，《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》中明確規定禁止將孔雀石綠應用于所有食品及動物。依據評估結論，MG和LMG的最高殘留限量為“不得檢出”。但由于沒有低廉有效的替代品，孔雀石綠在水產養殖中的使用一直屢禁不止。目前，對于孔雀石綠殘留的檢測方法主要以理化檢測法和免疫學方法為主。其中理化檢測法包括：薄層層析法、高效液相色譜法、拉曼光譜法、液質聯用法等。這些方法具有定量精度高的特點，但儀器成本高、操作復雜、檢測時間長，且不能用于現場檢測，因而不適用于基層單位的應用，無法滿足農產品市場準入制度實施對檢測方法時效性的需求。利用抗體與抗原的反應為核心發展起來的免疫學檢測方法主要有：酶聯吸附免疫法(ELISA)和免疫膠體金法(GICT)等，這些方法具有高通量檢測和操作簡便、快速等優點，因而尤其適合在基層單位的應用和現場快速檢測。開發藥物殘留檢測免疫試劑盒所面臨的主要難題除了檢測結果假陽性、假陰性率偏高，還有其核心原料(抗體)批量小、批間差異大且價格昂貴。出現假陽性和假陰性分別是由于方法的特異性和靈敏度不夠，而免疫學檢測方法的特異性和靈敏度又主要由抗體所決定。常用的單克隆抗體生產方法是將雜交瘤細胞輸入動物體內，當動物腹部膨大產生腹水時，再抽取腹水獲得抗體，但此方法不足之處為小鼠腹水量少而且動物個體差異使每只動物所產抗體的質量和產量均有較大差異，從而造成抗體批量小且批間差異大；而有些國家和地區禁止在動物體內制備抗體。
技術實現思路
本專利技術提供了一種分泌抗孔雀石綠單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用，該雜交瘤細胞株能夠在體外培養條件下大量分泌高靈敏度、高特異性的抗孔雀石綠單克隆抗體。一種分泌抗孔雀石綠單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為雜交瘤細胞株MGA7，已于2016年4月27日保藏于中國典型培養物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection，簡稱CCTCC)，保藏編號為CCTCCNO:C201666；中國典型培養物保藏中心的地址為：湖北省武漢市武昌區武漢大學保藏中心。本專利技術提供了一種制備所述雜交瘤細胞株的方法，包括：(1)將牛血清白蛋白和羧基隱性孔雀石綠混合制備偶聯物，再用所述偶聯物免疫動物，獲得脾細胞；(2)將所述脾細胞與骨髓瘤細胞融合，經篩選、克隆后，獲得所述雜交瘤細胞株；所述羧基隱性孔雀石綠與牛血清白蛋白的投料摩爾比為30～50:1；所述偶聯物的偶聯比為2～5:1。作為優選，所述的篩選和克隆在無抗菌素的條件下進行。具體地，所述的動物為BALB/c小鼠。所述骨髓瘤細胞為復壯的SP2/0細胞。所述雜交瘤細胞株的抗體基因型：重鏈(IgG)V基因為MusmusIGHV1-39*01F，J基因為MusmusIGHJ2*01F，D基因為MusmusIGHD1-1*01F；輕鏈(kappa)V基因為MusmusIGKV4-55*01F，J基因為MusmusIGKJ1*01F。本專利技術還提供了一種單克隆抗體，由所述的雜交瘤細胞株或其傳代細胞株分泌產生。具體地，所述單克隆抗體的亞型為IgMk鏈，與隱性孔雀石綠有特異性反應，對孔雀石綠、結晶紫和隱性結晶紫均有較高的親和力。作為優選，所述單克隆抗體由所述雜交瘤細胞株或其傳代細胞株經體外培養方式獲得。具體地，本專利技術采用雜交瘤細胞株或其傳代細胞在1640培養基中培養，當細胞進入對數生長期，收集細胞上清液，再利用硫酸銨沉淀法和透析法獲得初步純化的抗體。本專利技術還提供了所述的單克隆抗體在檢測動物源食用農產品中孔雀石綠及其代謝物中的應用。本專利技術還提供了一種檢測孔雀石綠及其代謝物的試劑盒，含有所述的單克隆抗體。具體地，所述的試劑盒中含有所述雜交瘤細胞株或其傳代細胞株分泌產生的單克隆抗體、酶標板、孔雀石綠及其代謝物標準品，酶標記物(酶標二抗)、底物和終止液，其中，酶標板上包被有人工合成的抗原(競爭物)。使用時，待檢樣品與抗體加入酶標板完成反應后，再加入酶標記物，若樣品中含有孔雀石綠及其代謝物，則會與酶標板上的抗原競爭結合抗體，再加入底物反應，終止顯色。顯色強度與樣品中殘留的孔雀石綠及其代謝物量成反比。根據孔雀石綠及其代謝物標準品做出的標準曲線，計算出樣品中的孔雀石綠及其代謝物的含量。與現有技術相比，本專利技術具有的有益效果為：本專利技術以羧基隱性孔雀石綠與牛血清白蛋白形成的偶聯物為抗原，免疫BALB/c小鼠，再將免疫后的小鼠的脾臟細胞與復壯的SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，并采用不添加抗菌素的培養基進行細胞培養，經多次篩選和克隆獲得雜交瘤細胞株；該雜交瘤細胞株分泌IgMk鏈單克隆抗體靈敏度高，特異性強，可用于孔雀石綠的快速、準確免疫檢測和免疫分析。附圖說明圖1為羧基隱性孔雀石綠的正離子質譜圖；圖2為羧基隱性孔雀石綠、卵清蛋白、抗原羧基隱性孔雀石綠-卵清蛋白偶聯物(CLMG-OVA)的光譜疊加圖；圖3為雜交瘤細胞株MGA7的染色體標本；圖4為單抗對孔雀石綠(MG)間接競爭ELISA的標準曲線；具體實施方式下面結合具體實施例對本專利技術作進一步說明。實施例1雜交瘤細胞株MGA7于2016年4月27日送達中國典型培養物保藏中心(地址：中國.武漢.武漢大學)，該細胞株的存活性于2016年5月8日檢測結果為存活，保藏編號CCTCCNo:C201666。該雜交瘤細胞株通過羧基隱性孔雀石綠(CLMG)與牛血清白蛋白(BSA)的偶聯物(CLMG-BSA)為抗原，免疫BALB/c小鼠，將免疫后小鼠的脾臟細胞與經復壯的SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，采用不添加抗菌素的培養基進行細胞培養，經過篩選和3次克隆獲得。具體過程如下：(1)半抗原(羧基隱性孔雀石綠)的合成與純化IKA磁力攪拌器的加熱板上加裝油浴裝置和精密反饋式溫控器→稱取0.9001g對醛基苯甲酸、3.6012g無水氯化鋅放進三口燒瓶中，加入3.6mLN,N-二甲基苯胺、90mL無水乙醇→置于油浴裝置中，用橡膠塞密住加樣口，中口接蛇形冷凝管，另一口通入氮氣管→在冷凝管上端放一個加塞脫脂棉的小漏斗，用封口膜蜜封三口燒瓶所有接口處。檢查氣密性后，接通氮氣和冷卻水，開始加熱→在氮氣保護下，100±0.2℃冷凝回流反應24h→停止加熱，繼續在氮氣保護下冷卻至室溫→取出燒瓶，密封，用12層紗布包裹后，垂直放入小瓦楞紙箱內，用舊報紙固定后，-20℃靜置72h→取出燒瓶時，溶液固體明顯分層，上層液體為無色透明，燒瓶底部有淺綠色粘固體析出，即羧基隱性孔雀石綠(CLMG)粗產物→取少量粗產物溶解后，用高分辨離子肼質譜用正離子模式測定，測得產物分本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種分泌抗孔雀石綠單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其特征在于，命名為雜交瘤細胞株MG?A7，保藏編號為CCTCC?NO:C201666。

【技術特征摘要】
1.一種分泌抗孔雀石綠單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其特征在于，命名為雜交瘤細胞株MGA7，保藏編號為CCTCCNO:C201666。2.一種制備如權利要求1所述雜交瘤細胞株的方法，包括：(1)將牛血清白蛋白和羧基隱性孔雀石綠混合制備偶聯物，再用所述偶聯物免疫動物，獲得脾細胞；(2)將所述脾細胞與骨髓瘤細胞融合，經篩選、克隆后，獲得所述雜交瘤細胞株；其特征在于，所述羧基隱性孔雀石綠與牛血清白蛋白的投料摩爾比為30～50:1；所述偶聯物的偶聯比率2～5:1。3.如權利要求2所述的方法，其特征在...

【專利技術屬性】
技術研發人員：柳愛春，劉超，
申請(專利權)人：杭州市農業科學研究院，
類型：發明
國別省市：浙江,33