一種重組人尿激酶原的病毒去除方法技術

本發明專利技術涉及一種重組人尿激酶原的病毒去除方法，所述方法包括，將重組人尿激酶原發酵液通過層析后獲得的初步純化液進行離子交換層析，使病毒牢固吸附在離子交換介質上，而重組人尿激酶原直接被洗脫下來。該方法對病毒的去除效果大于99.99％。

【技術實現步驟摘要】
一種重組人尿激酶原的病毒去除方法
本專利技術屬于醫藥領域，尤其是涉及一種重組人尿激酶原的病毒去除方法。
技術介紹
尿激酶原是尿激酶的前體，是一種糖蛋白，由411個氨基酸組成，其本身無活性，經纖維蛋白溶解酶和激肽酶的激活，使其Lys158-Ile159之間的肽鏈打開形成尿激酶，才能發揮其溶血栓的效能。是一種特異性的溶血栓的藥物。上海天士力生產的重組人尿激酶原為通過基因工程方法構建的中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)表達獲得的，主要用于急性ST段抬高性心肌梗死的溶栓治療，已于2011年作為國家一類新藥成功上市。國家食品藥品監督管理局藥品審評中心制定的《生物組織提取制品和真核細胞表達制品的病毒安全性評價技術審評一般原則》(簡稱原則)規定，凡是用細胞表達的人用生物制品均要求對生產用細胞株、細胞培養液、產品原液和產品進行病毒檢測，并要求純化工藝中有滅活或除去病毒的步驟，以確保產品不被病毒污染及用藥安全。近年來，國內外多家實驗室相繼證實，離子交換層析，特別是陰離子交換層析(Anion-exchangechromatography，AEX)在純化蛋白質的同時，具有穩定可靠的去病毒作用。陰離子交換層析對包括DNA、RNA病毒，有脂包膜和無脂包膜病毒等指示性病毒的去除效率均在99.99％(即4log10)以上。
技術實現思路
為了解決上述技術問題，本專利技術提供了一種有效去除重組人尿激酶原病毒的方法。本專利技術是通過以下技術方案實現的：本專利技術以重組人尿激酶原發酵液為起始原料，對其進行純化并取病毒處理，為此本專利技術提供一種重組人尿激酶原的病毒去除方法，所述方法包括用離子交換層析柱對重組人尿激酶原進行純化的步驟。本專利技術所述方法，還包括將重組人尿激酶原發酵液通過層析后獲得的初步純化液的步驟；本專利技術所述進行離子交換層析，可以使病毒例如DNA、RNA病毒、有脂包膜和無脂包膜病毒牢固吸附在離子交換介質上，而重組人尿激酶原直接被洗脫下來，從而達到去除病毒的目的。本專利技術所述的離子交換層析包括陰離子交換層析或陽離子交換層析或其結合。本專利技術所述將重組人尿激酶原發酵液通過層析后獲得的初步純化液的步驟；是將重組人尿激酶原發酵液經過層析方法得到初步純化液≥95.0％；本專利技術所述用離子交換層析柱對重組人尿激酶原進行純化的步驟，共有三種技術方案，目的在于去除病毒：第一種技術方案，方法如下：初步純化液與Tris-HCl緩沖液混合，調節pH值后上樣，病毒被吸附在陰離子交換層析柱上，尿激酶原被Tris-HCl緩沖液洗脫直接穿透，根據UV280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即得純化后的重組人尿激酶原原液。優選的，本專利技術所述的用離子交換層析柱對重組人尿激酶原進行純化的步驟，方法如下：初步純化液與0.02～0.035mol/LTris-HCl緩沖液(pH8.0±0.5)按1：1.5～3(優選1:2)體積比混合，調節pH值至8.0±0.5后陰離子交換柱上樣，用0.015～0.025mol/LTris-HCl緩沖液洗脫直接穿透，根據UV280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化后的尿激酶原。本專利技術用離子交換層析柱對重組人尿激酶原進行純化的步驟中，所述的陰離子填料包括但不限于StreamlineDEAE、DEAESephacelDE-52，優選StreamlineDEAE陰離子填料。所述的Tris-HCl緩沖液為含鹽或不含鹽的Tris-HCl緩沖液，優選pH8.0±0.5含0～0.20mol/LNaCl，進一步優選初步純化液與不含鹽Tris-HCl緩沖液混合。為了更好的除去病毒，優選先用Tris-HCl含鹽緩沖液平衡層析柱后再上樣洗脫，平衡時Tris-HCl緩沖液含鹽濃度高于洗脫時Tris-HCl緩沖液含鹽濃度。優選平衡時Tris-HCl緩沖液液pH8.0±0.5含0.05～0.20mol/LNaCl，洗脫時Tris-HCl洗脫緩沖液(pH8.0±0.5含0.05～0.15mol/LNaCl)。更進一步地，以StreamlineDEAE陰離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.015～0.025mol/LTris-HCl平衡緩沖液(pH8.0±0.5含0.05～0.20mol/LNaCl)進行平衡。初步純化液與0.02～0.035mol/LTris-HCl緩沖液(pH8.0±0.5)按1：2體積比混合，調節pH值至8.0±0.5后上樣，病毒被吸附在陰離子交換層析柱上，尿激酶原被0.015～0.025mol/LTris-HCl緩沖液(pH8.0±0.5含0.05～0.15mol/LNaCl)洗脫直接穿透，根據UV280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化重組人尿激酶原。本專利技術通過陰離子填料吸附帶負電荷的DNA、宿主細胞殘留蛋白及病毒等在Tris-HCl緩沖液基礎上增加NaCl，增強雜質的負電荷強度，從而增加陰離子填料對DNA等雜質的吸附。本方第二種技術方案，方法如下：初步純化液與磷酸鹽緩沖液混合，調節pH值后上樣，病毒被吸附在陽離子交換層析柱上，重組人尿激酶原被磷酸鹽緩沖液洗脫直接穿透，根據UV280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即得純化后的重組人尿激酶原原液。優選的，初步純化液調節pH值至6.0±0.5后陽離子交換層析柱上樣，病毒被吸附在陽離子交換層析柱上，尿激酶原被0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫直接穿透，根據UV280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為純化的尿激酶原。所述的陽離子交換層析柱填料包括但不限于SPSepharoseF.F.、SPSephadexC-50，優選SPSepharoseF.F.陽離子填料，本專利技術所述的磷酸鹽緩沖液為含NaCl溶液，優選pH5.5～7.5含0.05～0.5mol/LNaCl。為了更好的洗脫，優選先用磷酸鹽緩沖液層析柱后再上樣洗脫，所述平衡層析柱的磷酸鹽緩沖液含NaCl濃度低于洗脫時磷酸鹽緩沖液含NaCl濃度，也就是說低鹽磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，再用高鹽磷酸鹽緩沖液洗脫層析柱。優選pH6.0±0.5含0.05～0.15mol/LNaCl進行平衡，用(pH7.0±0.5含0.3～0.5mol/LNaCl)洗脫。更進一步地，以SPSepharoseF.F.陽離子填料為介質進行交換層析。層析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0±0.5含0.05～0.15mol/LNaCl)進行平衡，初步純化液調節pH值至6.0±0.5后上樣，病毒被吸附在陽離子交換層析柱上，尿激酶原用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0±0.5含0.3～0.5mol/LNaCl)洗脫直接穿透，根據UV280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為純化的尿激酶原。本專利技術的第三種技術方案，方法如下：初步純化液經過陰離子交換層析柱吸附，初步純化液與Tris-HCl緩沖液混合，調節pH值后上樣，病毒被吸附在陰離子交換層析柱上，尿激酶原被Tris-HCl緩沖液洗脫直接穿透，根據UV280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即得純化后的尿激酶原1；尿激酶原1再經過陽離子交換層析柱吸附，尿激酶原1與磷酸鹽緩沖液混合，調節pH值后上樣，病毒被吸附在陽離子交換層析柱上，尿激酶原1被磷酸鹽緩沖液洗脫直接穿透，本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種重組人尿激酶原的病毒去除方法，其特征在于，所述方法包括用離子交換層析柱對重組人尿激酶原進行純化的步驟。

【技術特征摘要】
1.一種重組人尿激酶原的病毒去除方法，其特征在于，所述方法包括用離子交換層析柱對重組人尿激酶原進行純化的步驟。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法，還包括將重組人尿激酶原發酵液通過層析后獲得的初步純化液的步驟。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的離子交換層析是陰離子交換層析或陽離子交換層析或其結合。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，利用陰離子交換層析去除重組人尿激酶原病毒的方法，包括如下步驟：初步純化液經過陰離子交換層析柱吸附，初步純化液與Tris-HCl緩沖液混合，調節pH值后上樣，病毒被吸附在陰離子交換層析柱上，尿激酶原被Tris-HCl緩沖液洗脫直接穿透，根據UV280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即得純化后的重組人尿激酶原原液。5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，其中以陰離子填料為介質進行交換層析，層析柱采用0.015～0.025mol/LTris-HCl平衡緩沖液pH8.0±0.5含0.05～0.20mol/LNaCl進行平衡，初步純化液與0.02～0.035mol/LTris-HCl緩沖液pH8.0±0.5按1：1.5-3體積比混合，調節pH值至8.0±0.5后上樣，病毒被吸附在陰離子交換層析柱上，尿激酶原被0.015～0.025mol/LTris-HCl緩沖液pH8.0±0.5含0.05～0.15mol/LNaCl洗脫直接穿透，根據UV280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化重組人尿激酶原。6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，利用陽離子交換層析去除重組人尿激酶原病毒，其包括如下步驟：初步純化液經過陽離子交換層析柱吸附，初步純化液與磷酸鹽緩沖液混合，調節pH值后上樣，病毒被吸附在陽離子交換層析柱上，重組人尿激酶原被磷酸鹽緩沖液洗脫直接穿透，根據UV280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即得純化后的重組人尿激酶原原液。7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，以陽離子填料為介質進行交換層析，層析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液pH6.0±0.5含0.05～0.15mol/LNaCl進行平衡，純化尿激酶原1調節pH值至6.0±0.5后上樣，病毒被吸附在陽離子交換層析柱上，尿激酶原1用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液pH7.0±0.5含0.3～0.5mol/LNaCl洗脫直接穿透，根據UV280紫外吸收曲線收集目標蛋白峰，即為純化的重組人尿激酶原。8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，利用陰離子和陽離子交換層析去除重組人尿激酶原病毒，包括如下步驟：初步純化液經過陰離子交換層析柱吸附，初步純化液與Tris-HCl緩沖液混合，調節pH值后上樣，病毒被吸附在陰離子交換層析柱上，尿激酶原被Tris-HCl緩沖液洗脫直接穿透，根據UV280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即得純化后的尿激酶原1；尿激酶原1再經過陽離子交換層析柱吸附，尿激酶原1與磷酸鹽緩沖液混合，調節pH值后上樣，病毒被吸附在陽離子交換層析柱上，尿激酶原1被磷酸鹽緩沖液洗脫直接穿透，根據UV280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即得純化后的重組人尿激酶原原液。9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，以陰離子填料為介質進行交換層析，層析柱采用0.015～0.025mol/LTris-HCl平衡緩沖液...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李雪峰，趙國焓，韓進，
申請(專利權)人：上海天士力藥業有限公司，
類型：發明
國別省市：上海,31