鐮刀菌病病原菌RT-PCR檢測(cè)引物和探針組合及試劑盒制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供一種鐮刀菌病病原菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物和探針組合及試劑盒。所述引物和探針組合的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1?12所示。本發(fā)明專利技術(shù)的試劑盒能夠快速、特異、靈敏、穩(wěn)定對(duì)角膜鐮刀菌病病原菌進(jìn)行分子診斷。在建立了可靠的鐮刀菌病病原菌檢測(cè)體系的基礎(chǔ)上，本發(fā)明專利技術(shù)針對(duì)性地設(shè)計(jì)了競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)參，確保陰性結(jié)果的真實(shí)可信。同時(shí)，本發(fā)明專利技術(shù)提供的試劑盒包含改良的DNA提取體系，能快速有效地完成DNA提取過(guò)程，使檢測(cè)更為快捷方便。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
鐮刀菌病病原菌RT-PCR檢測(cè)引物和探針組合及試劑盒
本專利技術(shù)屬于微生物檢測(cè)
，具體地說(shuō)，涉及鐮刀菌病病原菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)引物和探針組合及試劑盒。
技術(shù)介紹
真菌性角膜炎是一種世界范圍內(nèi)常見的致盲性眼病，多見于包括中國(guó)在內(nèi)的農(nóng)業(yè)人口為主的發(fā)展中國(guó)家。其中，又以鐮刀菌屬真菌引起的角膜鐮刀菌病最為常見。統(tǒng)計(jì)資料表明，同仁醫(yī)院眼科研究所報(bào)告的775例真菌性角膜炎中，角膜鐮刀菌占58.7％，其病原菌以茄病鐮刀菌、串珠鐮刀菌和尖孢鐮刀菌為主。近年來(lái)，隨著廣譜抗生素、皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和抗腫瘤藥物的廣泛應(yīng)用，角膜鐮刀菌病的發(fā)病率有較明顯的上升趨勢(shì)。角膜鐮刀菌病起病緩慢，外用抗生素?zé)o效，早期主要癥狀包括疼痛、畏光、紅腫、視力模糊，如治療不及時(shí)，可以引起角膜穿孔，導(dǎo)致失明。因此，真菌性角膜炎的早期診斷對(duì)防盲、治盲意義重大，只有早期及時(shí)確診，才能合理治療。目前，臨床上常用的診斷方法包括鏡檢、培養(yǎng)、共聚焦顯微鏡檢查、組織病理檢查等。但除培養(yǎng)外，都不能達(dá)到真菌鑒定到種水平。而真菌培養(yǎng)，耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，一般需1-2周，不適用于臨床早期診斷。因此，開發(fā)精準(zhǔn)的分子診斷技術(shù)，用于對(duì)角膜鐮刀菌病的診療，有著非常重要的意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種鐮刀菌病病原菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)引物和探針組合及試劑盒。本專利技術(shù)的另一目的是提供一種用于非疾病診斷目的檢測(cè)鐮刀菌病病菌的方法。本專利技術(shù)的再一目的是提供一種改良的真菌DNA提取液。為了實(shí)現(xiàn)本專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)的鐮刀菌病病原菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物和探針組合，該組合包括：(I)用于檢測(cè)鐮刀菌的通用引物和探針，所述鐮刀菌包括茄病鐮刀菌、串珠鐮刀菌和尖孢鐮刀菌(SEQIDNO:1-3)Fpan-F：5′-GCCCGAGTTGTAATTTGTAGAG-3′Fpan-R：5′-AACCAGACGGGGCTCTCAC-3′Fpan-P：5′-FAM-GGTGCCTTCCGAGTTCCCTGG-BHQ1-3′(II)用于檢測(cè)串珠鐮刀菌的特異性引物和探針(SEQIDNO:4-6)Fmon-F：5′-CGCATGAGTGTTTACTTCAACG-3′Fmon-R：5′-AGGTCGACGAGGACGGCT-3′Fmon-P：5′-FAM-AGCAGTCAA[T]G[T]CAAGAGTTCA-BHQ1-3′；其中，[T]表示鎖核酸；(III)用于檢測(cè)茄病鐮刀菌的特異性引物和探針(SEQIDNO:7-9)Fsol-F：5′-GCATGAGCGTCTACTTCAAC-3′Fsol-R：5′-AAGGGACCAGCACGAACG-3′Fsol-P：5′-FAM-AGCTGACATCTGTAGGCTTCTGGTAA-BHQ1-3′；以及(IV)用于檢測(cè)尖孢鐮刀菌的特異性引物和探針(SEQIDNO:10-12)Foxy-F：5′-TGTCTACTTCAACGAGGTATGC-3′Foxy-R：5′-CATGGTACCAGGCTCAAGAT-3′Foxy-P：5′-FAM-AATTCCCAAGCTCACACAACTAGG-BHQ1-3′。本專利技術(shù)還提供與上述引物和探針組合配套使用的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)參模板(SEQIDNO:13-15)和內(nèi)參探針(SEQIDNO:17)。本專利技術(shù)還提供含有所述引物和探針組合的用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)鐮刀菌病病原菌的試劑盒。所述試劑盒還包括競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)參模板Fpan-IAC、Fmon-IAC、Fsol-IAC、Foxy-IAC和內(nèi)參探針Fu-IACP，其序列信息如下：Fpan-IAC：5′-GCCCGAGTTGTAATTTGTAGAGCTAGATGACTGAGCACGTCTATCCGATGATCATGGTGAGAGCCCCGTCTGGTT-3′(SEQIDNO:13)Fmon-IAC：5′-CGCATGAGTGTTTACTTCAACGCTAGATGACTGAGCACGTCTATCCGATGATCATGAGCCGTCCTCGTCGACCT-3′(SEQIDNO:14)Fsol-IAC：5′-GCATGAGCGTCTACTTCAACCTAGATGACTGAGCACGTCTATCCGATGATCATGCGTTCGTGCTGGTCCCTT-3′(SEQIDNO:15)Foxy-IAC：5′-TGTCTACTTCAACGAGGTATGCCTAGATGACTGAGCACGTCTATCCGATGATCATGATCTTGAGCCTGGTACCATG-3′(SEQIDNO:16)Fu-IACP：5′-TAMRA-ACTGAGCACGTCTATCCGA-BHQ1-3′(SEQIDNO:17)。所述試劑盒進(jìn)一步包括真菌DNA提取液和/或玻璃珠等；所述真菌DNA提取液的配方如下：800mMTris-HClpH9.5200mMEDTApH8.0100mMNaHCO3300mMKCl所述玻璃珠優(yōu)選為直徑710-1180μm的酸洗玻璃珠。本專利技術(shù)還提供一種用于非疾病診斷目的檢測(cè)鐮刀菌病病菌的方法，包括以下步驟：1)提取待測(cè)樣品的DNA；2)以上述提取的DNA為模板，利用本專利技術(shù)的試劑盒，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增；3)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的配制如下：(1)依次配制如下試劑①PCRmixtureA，配方如下：②PCRmixtureB，配方如下：③PCRmixtureC，配方如下：④PCRmixtureD，配方如下：⑤PCRmixtureE，配方如下：(2)鐮刀菌檢測(cè)體系的配制取15μl的PCRmixtureA和13μl的PCRmixtureB混合，加入2μlDNA模板，即得；(3)串珠鐮刀菌檢測(cè)體系的配制取15μl的PCRmixtureA和13μl的PCRmixtureC混合，加入2μlDNA模板，即得；(4)茄病鐮刀菌檢測(cè)體系的配制取15μl的PCRmixtureA和13μl的PCRmixtureD混合，加入2μlDNA模板，即得；(5)尖孢鐮刀菌檢測(cè)體系的配制取15μl的PCRmixtureA和13μl的PCRmixtureE混合，加入2μlDNA模板，即得。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：95℃10min；95℃15s，54℃20s，72℃30s(采集數(shù)據(jù))，共40個(gè)循環(huán)。前述方法中，步驟3)根據(jù)是否出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，分析待測(cè)樣品中是否含有相應(yīng)的鐮刀菌病病原菌；含有病原菌的待測(cè)樣品會(huì)出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線，表現(xiàn)為陽(yáng)性結(jié)果；不含有病原菌的待測(cè)樣品不出現(xiàn)擴(kuò)增曲線或擴(kuò)增曲線在檢測(cè)閾值之下，表現(xiàn)為陰性結(jié)果。本專利技術(shù)提供一種能快速、穩(wěn)定地組織標(biāo)本中提取核酸的方法，具體如下：S1、采集待測(cè)樣本100-500mg加入2ml離心管中，向離心管中加入600μl真菌DNA提取液和0.5g玻璃珠，在TissueLyserII(Qiagen公司)上30Hz震蕩10min，或渦旋震蕩10min；S2、95℃溫育10min，14000rpm離心5min，取上清，作為DNA模板。可將上述提取核酸的方法用于非疾病診斷目的檢測(cè)鐮刀菌病病菌方法的步驟1)。本專利技術(shù)提供的鐮刀菌病病原菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物和探針組合及試劑盒，能夠快速、特異、靈敏、穩(wěn)定對(duì)鐮刀菌病病原菌進(jìn)行分子診斷。在本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
鐮刀菌病病原菌RT?PCR檢測(cè)引物和探針組合，其特征在于，該組合包括：(I)用于檢測(cè)鐮刀菌的通用引物和探針，所述鐮刀菌包括茄病鐮刀菌、串珠鐮刀菌和尖孢鐮刀菌Fpan?F：5′?GCCCGAGTTGTAATTTGTAGAG?3′Fpan?R：5′?AACCAGACGGGGCTCTCAC?3′Fpan?P：5′?FAM?GGTGCCTTCCGAGTTCCCTGG?BHQ1?3′(II)用于檢測(cè)串珠鐮刀菌的特異性引物和探針Fmon?F：5′?CGCATGAGTGTTTACTTCAACG?3′Fmon?R：5′?AGGTCGACGAGGACGGCT?3′Fmon?P：5′?FAM?AGCAGTCAA[T]G[T]CAAGAGTTCA?BHQ1?3′；其中，[T]表示鎖核酸；(III)用于檢測(cè)茄病鐮刀菌的特異性引物和探針Fsol?F：5′?GCATGAGCGTCTACTTCAAC?3′Fsol?R：5′?AAGGGACCAGCACGAACG?3′Fsol?P：5′?FAM?AGCTGACATCTGTAGGCTTCTGGTAA?BHQ1?3′；以及(IV)用于檢測(cè)尖孢鐮刀菌的特異性引物和探針Foxy?F：5′?TGTCTACTTCAACGAGGTATGC?3′Foxy?R：5′?CATGGTACCAGGCTCAAGAT?3′Foxy?P：5′?FAM?AATTCCCAAGCTCACACAACTAGG?BHQ1?3′。...

【技術(shù)特征摘要】
1.鐮刀菌病病原菌RT-PCR檢測(cè)引物和探針組合，其特征在于，該組合包括：(I)用于檢測(cè)鐮刀菌的通用引物和探針，所述鐮刀菌包括茄病鐮刀菌、串珠鐮刀菌和尖孢鐮刀菌Fpan-F：5′-GCCCGAGTTGTAATTTGTAGAG-3′Fpan-R：5′-AACCAGACGGGGCTCTCAC-3′Fpan-P：5′-FAM-GGTGCCTTCCGAGTTCCCTGG-BHQ1-3′(II)用于檢測(cè)串珠鐮刀菌的特異性引物和探針Fmon-F：5′-CGCATGAGTGTTTACTTCAACG-3′Fmon-R：5′-AGGTCGACGAGGACGGCT-3′Fmon-P：5′-FAM-AGCAGTCAA[T]G[T]CAAGAGTTCA-BHQ1-3′；其中，[T]表示鎖核酸；(III)用于檢測(cè)茄病鐮刀菌的特異性引物和探針Fsol-F：5′-GCATGAGCGTCTACTTCAAC-3′Fsol-R：5′-AAGGGACCAGCACGAACG-3′Fsol-P：5′-FAM-AGCTGACATCTGTAGGCTTCTGGTAA-BHQ1-3′；以及(IV)用于檢測(cè)尖孢鐮刀菌的特異性引物和探針Foxy-F：5′-TGTCTACTTCAACGAGGTATGC-3′Foxy-R：5′-CATGGTACCAGGCTCAAGAT-3′Foxy-P：5′-FAM-AATTCCCAAGCTCACACAACTAGG-BHQ1-3′。2.含有權(quán)利要求1所述引物和探針組合的用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)鐮刀菌病病原菌的試劑盒。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，還包括競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)參模板Fpan-IAC、Fmon-IAC、Fsol-IAC、Foxy-IAC和內(nèi)參探針Fu-IACP，其序列信息如下：Fpan-IAC：5′-GCCCGAGTTGTAATTTGTAGAGCTAGATGACTGAGCACGTCTATCCGATGATCATGGTGAGAGCCCCGTCTGGTT-3′Fmon-IAC：5′-CGCATGAGTGTTTACTTCAACGCTAGATGACTGAGCACGTCTATCCGATGATCATGAGCCGTCCTCGTCGACCT-3′Fsol-IAC：5′-GCATGAGCGTCTACTTCAACCTAGATGACTGAGCACGTCTATCCGATGATCATGCGTTCGTGCTGGTCCCTT-3′Foxy-IAC：5′-TGTCTACTTCAACGAGGTATGCCTAGATGACTGAGCACG...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：龔杰，張?chǎng)?/a>，吳偉偉，陳見友，陸捷潔，韓娜，張婷婷，黎青山，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：北京,11