用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)副結(jié)核分支桿菌的引物、探針及試劑盒制造技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)了一種用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)副結(jié)核分支桿菌的引物和探針組合，其正向引物序列如SEQ?ID?No.1所示，反向引物序列如SEQ?ID?No.2所示，探針序列如SEQ?ID?No.3所示。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)還公開(kāi)了用于檢測(cè)副結(jié)核分支桿菌的試劑盒。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)提供的副結(jié)核分支桿菌RPA?nfo檢測(cè)引物與探針組合以及試劑盒靈敏度高、特異性強(qiáng)，最低可以檢測(cè)到8拷貝/反應(yīng)的副結(jié)核分支桿菌DNA。無(wú)需特殊儀器設(shè)備，借助恒溫水浴鍋或人體腋窩溫度，25min就能對(duì)待測(cè)樣本的粗裂解物進(jìn)行副結(jié)核分支桿菌DNA的靈敏、特異、快速地檢測(cè)，適合現(xiàn)場(chǎng)或基層副結(jié)核病的診斷工作。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)副結(jié)核分支桿菌的引物、探針及試劑盒
本專(zhuān)利技術(shù)涉及微生物檢測(cè)
，具體涉及一種應(yīng)用重組酶聚合酶擴(kuò)增-側(cè)流層析試紙條技術(shù)，現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)副結(jié)核分支桿菌的引物、探針及試劑盒。
技術(shù)介紹
副結(jié)核病，也稱(chēng)副結(jié)核性腸炎，是由副結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumparatuberculosis，MAP)引起牛、羊、鹿以及駱駝等多種動(dòng)物的一種慢性傳染病。OIE將其列為B類(lèi)疫病，我國(guó)將其列為多種動(dòng)物共患的二類(lèi)動(dòng)物疫病。副結(jié)核分支桿菌主要感染牛、羊和鹿，發(fā)病動(dòng)物和隱性感染者是主要傳染源，它們可通過(guò)乳汁、糞便和尿排出大量的病原菌。本病的流行特點(diǎn)是發(fā)展緩慢，發(fā)病率不高，病死率極高，并且一旦在動(dòng)物群中出現(xiàn)則很難根除。近年來(lái)我國(guó)養(yǎng)殖場(chǎng)副結(jié)核病的感染率有上升的趨勢(shì)，一些養(yǎng)殖場(chǎng)依然沒(méi)有重視該病的防控。由于副結(jié)核病引起患病動(dòng)物消瘦、生產(chǎn)性能下降、增加飼料消耗及易感染其他疾病直至死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失相當(dāng)嚴(yán)重，因此，規(guī)模化牧場(chǎng)副結(jié)核病的檢疫與凈化顯得非常重要。目前，副結(jié)核病的診斷方法主要有病原學(xué)方法、變態(tài)反應(yīng)和血清學(xué)方法，其中，病原學(xué)主要有萋-尼氏抗酸染色、分離培養(yǎng)、PCR技術(shù)、LAMP快速檢測(cè)等。對(duì)于萋-尼氏抗酸染色而言，由于糞便樣品中可能還有其他的抗酸菌，會(huì)干擾染色法的診斷結(jié)果；對(duì)于分離培養(yǎng)法而言，分離培養(yǎng)耗時(shí)費(fèi)工，分離率也較低；PCR技術(shù)對(duì)儀器設(shè)備和技術(shù)人員依賴(lài)程度高，在基層條件差和技術(shù)人員匱乏的情況下，很難實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)實(shí)地快速診斷；LAMP快速檢測(cè)雖然可以進(jìn)行核酸的恒等溫?cái)U(kuò)增，但仍不能對(duì)核酸粗提物的DNA樣本進(jìn)行直接擴(kuò)增。此外，現(xiàn)有的采用PCR和LAMP診斷副結(jié)核病的報(bào)道中，其設(shè)計(jì)引物所依據(jù)的保守基因序列有多種，有的以副結(jié)核分枝桿菌ISMav2基因(AF286339)的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物(“牛副結(jié)核分支桿菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立”，中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2012年第39卷第10期)；有的以牛副結(jié)核分枝桿菌的IS900基因序列作為靶基因設(shè)計(jì)特異性引物(“牛副結(jié)核分枝桿菌LAMP快速檢測(cè)方法的建立”，中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012年6月)，而根據(jù)不同的靶標(biāo)(保守基因)設(shè)計(jì)的引物序列不同，對(duì)副結(jié)核分枝桿菌的診斷和檢測(cè)效果也存在較大差異，因此，選擇何種靶標(biāo)作為引物設(shè)計(jì)的依據(jù)也是病原學(xué)法診斷副結(jié)核分枝桿菌的難點(diǎn)之一。皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)能檢測(cè)出副結(jié)核感染前期的大部分發(fā)病動(dòng)物，但對(duì)于感染中后期以及處于耐受期的動(dòng)物敏感性不強(qiáng)或者不出現(xiàn)反應(yīng)狀態(tài)。動(dòng)物在感染副結(jié)核分枝桿菌后的前期并不產(chǎn)生抗體，只有在臨床癥狀階段才產(chǎn)生抗體，所以使用血清學(xué)方法可能漏檢副結(jié)核病陽(yáng)性動(dòng)物。因此，從臨床診斷的時(shí)效性方面考慮，亟需一種新的病原學(xué)現(xiàn)場(chǎng)快速恒等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)。重組酶聚合酶擴(kuò)增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)技術(shù)是目前新出現(xiàn)的一種體外快速核酸擴(kuò)增技術(shù)，在37℃左右就能發(fā)生反應(yīng)，并且僅需十幾分鐘就能擴(kuò)增出痕量級(jí)的檢測(cè)產(chǎn)物。同時(shí)RPA可以完成核酸粗提物的擴(kuò)增，它通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)和側(cè)流層析試紙條(LateralFlowDipstick，LFD)三種方式檢測(cè)結(jié)果，這三種方式的引物與探針?lè)磻?yīng)原理是不同的。基本的RPA擴(kuò)增只需上下游引物，產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)，而RPA-nfo和RPA-exo反應(yīng)，是通過(guò)不同的探針結(jié)合到模板互補(bǔ)鏈后再通過(guò)核酸內(nèi)切酶IV(nfo)和核酸內(nèi)切酶III(exo)切割掉3'端阻止序列，這兩種方法分別通過(guò)LFD(nfo)和實(shí)時(shí)熒光(exo)兩種不同的手段檢測(cè)結(jié)果。凝膠電泳和熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)法仍然依賴(lài)實(shí)驗(yàn)室和特殊儀器設(shè)備，而LFD是一種無(wú)需特殊儀器可用于現(xiàn)場(chǎng)的檢測(cè)方法。將RPA技術(shù)與LFD技術(shù)結(jié)合，通過(guò)LFD讀取結(jié)果，既不要求特殊儀器設(shè)備，也無(wú)需復(fù)雜的樣品處理，借助恒溫水浴鍋用LFD就可以通過(guò)肉眼觀察結(jié)果。但目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道利用RPA-LFD技術(shù)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)副結(jié)核分枝桿菌。但RPA技術(shù)屬于新興的核酸擴(kuò)增技術(shù)，其應(yīng)用并不十分普遍，其主要技術(shù)難點(diǎn)在于特異性引物和探針的設(shè)計(jì)和篩選，而引物/探針的設(shè)計(jì)和選擇對(duì)RPA-nfo的結(jié)果是至關(guān)重要的，目前并沒(méi)有像PCR擴(kuò)增技術(shù)那樣專(zhuān)門(mén)的引物/探針的設(shè)計(jì)軟件，也沒(méi)有較多的文獻(xiàn)和試驗(yàn)數(shù)據(jù)提供技術(shù)依據(jù)。經(jīng)相關(guān)檢索，目前還未有針對(duì)副結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行RPA-LFD檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。綜上，對(duì)于副結(jié)核分枝桿菌的RPA-LFD檢測(cè)，目前尚無(wú)明確可借鑒的思路和結(jié)果，還需要技術(shù)人員做大量和深入的研究。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本專(zhuān)利技術(shù)的目的是提供一種用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)副結(jié)核分支桿菌的引物、探針及試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專(zhuān)利技術(shù)采用如下技術(shù)方案：本專(zhuān)利技術(shù)的第一方面，提供一種用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)副結(jié)核分支桿菌的引物和探針組合，包括RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探針；其RPA-nfo正向引物序列如SEQIDNO.1所示，反向引物序列如SEQIDNO.2所示，其RPA-nfo探針序列如SEQIDNO.3所示。具體序列如下：正向引物：5'-TCGTCGTTGGCCACCCGCTGCGAGAGCAAT-3'；(SEQIDNO.1)反向引物：5'-(Biotin)ACTCGACCGCTAATTGAGAGATGCGATTG-3'；(SEQIDNO.2)探針：5'-(FAM)CCACAACCACCTCCGTAACCGTCATTGTC(dSpacer)AGATCAACCCAGCAGAC(C3-Spacer)-3'(SEQIDNO.3)。本專(zhuān)利技術(shù)的探針，在其5'端用FAM標(biāo)記，距離5'端30個(gè)堿基左右的位置處用dSpacer替代一個(gè)堿基，3’端用C3-spacer阻斷。需要說(shuō)明的是，與常規(guī)PCR反應(yīng)不同，RPA-nfo反應(yīng)所需引物的長(zhǎng)度通常為30～35bp，引物過(guò)短會(huì)嚴(yán)重影響重組酶的活性；但長(zhǎng)引物也并不一定能提高擴(kuò)增性能，反而還會(huì)增加形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能性。LF探針長(zhǎng)度一般在46～52bp，nfo核酶距離探針5'端30個(gè)堿基左右，距離3'端16～22個(gè)堿基左右，個(gè)別堿基的替換或增減都會(huì)對(duì)探針的特異性產(chǎn)生影響。因此，引物的設(shè)計(jì)和選擇對(duì)RPA的結(jié)果至關(guān)重要。RPA技術(shù)正處于起步研究階段，尚無(wú)專(zhuān)門(mén)的引物、探針設(shè)計(jì)軟件，也沒(méi)有大量的數(shù)據(jù)為其引物設(shè)計(jì)原則提供依據(jù)。因此，本專(zhuān)利技術(shù)的引物和探針組合是需要從靶標(biāo)序列兩端設(shè)計(jì)多對(duì)引物和探針組合，然后進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化、篩選才能得到。本專(zhuān)利技術(shù)設(shè)計(jì)了多組不同的引物和探針組合，經(jīng)試驗(yàn)反復(fù)驗(yàn)證后，確定本專(zhuān)利技術(shù)所列出的上述引物和探針組合，其檢測(cè)效果最佳。本專(zhuān)利技術(shù)的第二方面，提供一種用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)副結(jié)核分支桿菌的試劑盒，該試劑盒中包含上述的引物和探針組合。進(jìn)一步的，該試劑盒中還包括：陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品和RPA-nfo反應(yīng)液。所述陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為：包括副結(jié)核分支桿菌IS900基因片段的陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；優(yōu)選的，所述副結(jié)核分支桿菌IS900基因片段陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品由含有259個(gè)堿基的核苷酸片段構(gòu)成的pEASY-T3重組質(zhì)粒組成；所述含有259個(gè)堿基的核苷酸片段的序列如SEQIDNO.4所示，具體如下：5'-ATCAGCGCGGCACGGCTCTTGTTGTAGTCGAAGGCGCGTTCCAGCGCCGAAAGTATTCCAGCAGCTGGGCGCGCATTCGGTT本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)副結(jié)核分支桿菌的引物和探針組合，包括RPA?nfo正向引物、反向引物和RPA?nfo探針，其特征在于，所述RPA?nfo正向引物、反向引物和RPA?nfo探針的序列如下所示：正向引物：5'?TCGTCGTTGGCCACCCGCTGCGAGAGCAAT?3'；(SEQ?ID?NO.1)反向引物：5'?(Biotin)ACTCGACCGCTAATTGAGAGATGCGATTG?3'；(SEQ?ID?NO.2)探針：5'?(FAM)CCACAACCACCTCCGTAACCGTCATTGTC(dSpacer)AGATCAACCCAGCAGAC(C3?Spacer)?3'(SEQ?ID?NO.3)。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)副結(jié)核分支桿菌的引物和探針組合，包括RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探針，其特征在于，所述RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探針的序列如下所示：正向引物：5'-TCGTCGTTGGCCACCCGCTGCGAGAGCAAT-3'；(SEQIDNO.1)反向引物：5'-(Biotin)ACTCGACCGCTAATTGAGAGATGCGATTG-3'；(SEQIDNO.2)探針：5'-(FAM)CCACAACCACCTCCGTAACCGTCATTGTC(dSpacer)AGATCAACCCAGCAGAC(C3-Spacer)-3'(SEQIDNO.3)。2.權(quán)利要求1所述的引物和探針組合在制備副結(jié)核分支桿菌檢測(cè)的試劑盒、芯片和/或擴(kuò)增反應(yīng)試劑中的用途。3.一種檢測(cè)副結(jié)核分支桿菌的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含權(quán)利要求1所述的引物和探針組合。4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，試劑盒中還包括有：陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品和RPA-nfo反應(yīng)液。5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為包括副結(jié)核分支桿菌IS900基因片段的陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；優(yōu)選的，所述副結(jié)核分支桿菌IS900基因片段陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品由含有259個(gè)堿基的核苷酸片段構(gòu)成的pEASY-T3重組質(zhì)粒組成；所述含有259個(gè)堿基的核苷酸片段的序列如SEQIDNo.4所示。6.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為pEASY-T3空載質(zhì)粒。7.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：何洪彬，趙貴民，王洪梅，侯佩莉，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：山東師范大學(xué)，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：山東,37