一種RNA恒溫擴增熔解曲線法檢測臨床常見致病細菌的試劑盒及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一種RNA恒溫擴增熔解曲線法檢測臨床常見致病細菌的試劑盒及其應用，屬于生物檢測技術領域。本發明專利技術試劑盒能夠檢測臨床常見的16致病細菌：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、奇異變形桿菌、產氣腸桿菌、熒光假單胞菌、鮑曼不動桿菌、沙門氏菌、陰溝腸桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌、普通變形桿菌、表皮葡萄球菌、洋蔥克雷伯菌、噬麥芽食單胞菌的16S?rRNA，具有特異性高、靈敏度高、污染低及準確、快速檢測的特點，將在臨床微生物的快速鑒定和檢測分析中發揮重要作用，應用前景廣闊。

【技術實現步驟摘要】
一種RNA恒溫擴增熔解曲線法檢測臨床常見致病細菌的試劑盒及其應用
本專利技術屬于生物檢測
，涉及一種RNA恒溫擴增熔解曲線法檢測臨床常見致病細菌的試劑盒及檢測方法。適用于臨床常見致病細菌的菌種鑒定，可以為臨床細菌感染患者合理地進行抗菌藥物治療提供指導。
技術介紹
細菌感染是臨床常見的感染性疾病，其發病率和死亡率高，如果得不到早期的診斷和治療，會嚴重危及患者的生命。從臨床樣本中直接分離得到細菌表示感染嚴重需要立即進行抗菌治療。不同的致病菌對藥物種類和濃度的敏感性不同，治療成功的關鍵在于早期應用合適足量的藥物。而傳統的檢測致病菌的方法如顯微鏡檢查、培養法、生物化學檢查和免疫學方法等，由于各種因素的影響，通常需要幾種方法聯合使用，而且耗時也較長，需要1～3d，這期間用藥不當往往使得患者病情加重或增加菌株耐藥性。特別是在多種細菌聯合感染的情況下，更增加了菌種鑒定和用藥的復雜性。因此，建立一種快速且特異性強的微生物檢測方法是十分必要的。PCR方法是近年來發展起來的診斷技術，這種技術快速、靈敏，在臨床微生物檢測方面獲得了極為廣泛的應用；但是PCR檢測方法也存在一些不足，如檢測每一種病原菌都需要特異性引物，因而每次反應只能確定一種病原菌的有無，這種“一對一”的模式不適合檢測混合感染的復雜標本。臨床微生物的檢測急需建立一種“一對多”的檢測系統，可以通過一次反應檢測多種目標病原體。而通過恒溫擴增-分子信標探針——一種新興的高通量檢測技術，使得通過一次反應對多種病原菌的同時檢測成為可能。轉錄介導的核酸擴增技術(Transcriptionmediatedamplification，恒溫擴增)是近年來發展起來的一種直接快速檢測RNA的等溫擴增技術，它克服了以往核酸擴增的不足，更為簡便高效，尤其適用于RNA病毒的檢測。與PCR不同，恒溫擴增是在M-MLV、T7RNA聚合酶兩種酶的共同協作下，在41～42℃，由一對引物指導的連續均一的體外特異核苷酸序列等溫擴增酶促反應。其中一條引物其5’端具有被T7RNA聚合酶識別的啟動子序列。在恒溫擴增基礎上結合分子信標(molecularbeacon)探針建立的等溫擴增技術，具有以下優點：⑴等溫擴增：反應在同一恒溫體系條件下進行；⑵快速高效、靈敏度高:該反應時一種無需升降溫的連續快速擴增，也不需RT-PCR反應中第一階段15～30分鐘的反轉錄過程，整個反應時間短、單鏈RNA產物積累迅速，可以在30～60分鐘內完成檢測，一個反應可同時完成對多種臨床常見致病細菌的快速鑒定；并使模板RNA擴增109倍以上，靈敏度甚至可以達到檢測拷貝數為個位的模板RNA。恒溫擴增技術比目前商品化的免疫檢測試劑盒敏感10～1000倍，比常規PCR方法也敏感10～100倍；⑶特異性強：反應不需高溫變性，即使有雙鏈DNA污染也不會被擴增，而通過分子信標探針進行熔解曲線分析進一步提高了檢測的特異性和靈敏度；⑷設計簡單：只需設計1對引物和1條探針來識別靶RNA的3個不同區域。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是提供一種RNA恒溫擴增熔解曲線法檢測臨床常見致病細菌的試劑盒及其應用，以解決現有技術中臨床常見致病細菌檢測方法靈敏度較低，檢測周期長、易污染出現假陽性或假陰性以及檢測成本較高的問題。為解決上述技術問題，本專利技術提供如下技術方案：一種RNA恒溫擴增熔解曲線法檢測臨床常見致病細菌的引物和分子信標探針，包括如下序列：正向引物F1：其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；反向引物R1：其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；正向引物F2：其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；反向引物R2：其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；分子信標探針P1：其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；分子信標探針P2：其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；分子信標探針P3：其核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。所述反向引物R1的5’端的31個堿基是增加的T7噬菌體啟動子序列，而3’端20個堿基是與細菌16SrRNA互補的特異性序列；所述反向引物R2的5’端的31個堿基是增加的T7噬菌體啟動子序列，而3’端20個堿基是與細菌16SrRNA互補的特異性序列。所述分子信標探針P1的5’端和3’端的6個堿基是形成探針特征性發夾結構莖端區的反向互補序列，探針分子中間的40個堿基是與細菌16SrRNA反義鏈互補的特異性序列；所述分子信標探針P2的5’端和3’端的7個堿基是形成探針特征性發夾結構莖端區的反向互補序列，探針分子中間的34個堿基是與細菌16SrRNA反義鏈互補的特異性序列；所述分子信標探針P3的5’端和3’端的7個堿基是形成探針特征性發夾結構莖端區的反向互補序列，探針分子中間的40個堿基是與細菌16SrRNA反義鏈互補的特異性序列。其中，所述分子信標探針P1，其寡核苷酸DNA分子的5’端標記熒光報告基團CY5，3’端標記熒光淬滅基團DABCYL；所述分子信標探針P2，其寡核苷酸DNA分子的5’端標記熒光報告基團HEX，3’端標記熒光淬滅基團DABCYL；所述分子信標探針P3，其寡核苷酸DNA分子的5’端標記熒光報告基團FAM，3’端標記熒光淬滅基團DABCYL。一種RNA恒溫擴增熔解曲線法檢測臨床常見致病細菌的試劑盒，包括如下試劑：2×恒溫擴增反應液、5×酶混合液；其中，2×恒溫擴增反應液的配方如下：Tris-HClpH8.080mM、KCl140mM、MgCl224mM、DTT10mM、dNTP2mM、NTP4mM、甜菜堿2M、體積分數為30％的DMSO、正向引物F10.4μM、反向引物R10.4μM、正向引物F20.4μM、反向引物R20.4μM、分子信標探針P10.05μM、分子信標探針P20.05μM、分子信標探針P30.1μM。其中，所述5×酶混合液的配方如下：M-MLV20U/μl、T7RNA聚合酶100U/μl、BSA10.5ug/μl。作為優選該試劑盒包括空白對照，所述空白對照為無核酸酶的DEPC水。上述RNA恒溫擴增熔解曲線法檢測臨床常見致病細菌的試劑盒在檢測致病細菌中的應用在本專利技術的保護范圍之內。一種RNA等溫擴增熔解曲線法檢測臨床常見致病細菌的方法，包括以下步驟：(1)待測樣品RNA的提取；(2)RNA恒溫擴增反應和熔解曲線檢測：取12.5ul2×恒溫擴增反應液，5ul模板RNA溶液，加DEPC水補充至20ul，分別以待測樣本、陰性對照(經過核酸提取過程的無菌生理鹽水)、空白對照作為模板，加入96孔板反應孔中；RNA恒溫擴增：65℃保溫5分鐘，41℃保溫5分鐘；向96孔板反應孔中加入5ul酶混合液，瞬時離心；將96孔板放入熒光定量PCR儀中，41℃反應30分鐘；熔解曲線檢測：按照0.14℃/step升溫速率，從40℃到75℃逐漸升高溫度，熔解曲線分析程序記錄每一次升溫分子信標產生的熒光值。Meltinganalysis程序在熒光定量PCR儀(LightCycler480型，Roche公司)上進行。本專利技術試劑盒能夠檢測臨床常見的致病細菌如金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、奇異變形桿菌、產氣腸桿菌、熒光假單胞菌、鮑曼不動桿菌、沙門氏菌、陰溝腸桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌、普通變形桿菌、表皮葡萄球菌、洋蔥克本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種RNA恒溫擴增熔解曲線法檢測臨床常見致病細菌的引物和分子信標探針，其特征在于，包括如下序列：正向引物F1：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；反向引物R1：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；正向引物F2：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示；反向引物R2：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示；分子信標探針P1：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示；分子信標探針P2：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.6所示；分子信標探針P3：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.7所示。

【技術特征摘要】
1.一種RNA恒溫擴增熔解曲線法檢測臨床常見致病細菌的引物和分子信標探針，其特征在于，包括如下序列：正向引物F1：其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；反向引物R1：其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；正向引物F2：其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；反向引物R2：其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；分子信標探針P1：其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；分子信標探針P2：其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；分子信標探針P3：其核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。2.根據權利要求RNA恒溫擴增熔解曲線法檢測臨床常見致病細菌的引物和分子信標探針，其特征在于，所述分子信標探針P1，其寡核苷酸DNA分子的5’端標記熒光報告基團CY5，3’端標記熒光淬滅基團DABCYL；所述分子信標探針P2，其寡核苷酸DNA分子的5’端標記熒光報告基團HEX，3’端標記熒光淬滅基團DABCYL；所述分子信標探針P3，其寡核苷酸DNA分子的5’端標記熒光報告基團FAM，3’端標記熒光淬滅基團DABCYL。3.一種RNA恒溫擴增熔解曲線法檢測臨床常見致病細菌的試劑盒，其特征在于，包括如下試劑：2×恒溫擴增反應液、...

【專利技術屬性】
技術研發人員：任緒義，羅英，
申請(專利權)人：溫州迪安醫學檢驗所有限公司，
類型：發明
國別省市：浙江,33