一種檢測汞離子的比色生物傳感器及其制備方法技術

本發明專利技術涉及生物傳感器技術領域，特別涉及一種檢測汞離子的比色生物傳感器及其制備方法。由以下制備方法制備而成：合成金納米粒子；將Probe4修飾到金納米粒子表面；將標記的納米金溶液與均相反應溶液混合。本發明專利技術利用了核酸適配體的特異型識別，利用“T?Hg

Colorimetric biological sensor for detecting mercury ion and preparation method thereof

The invention relates to the technical field of biological sensors, in particular to a colorimetric biosensor for detecting mercury ions and a preparation method thereof. Prepared by the following preparation methods: synthesizing gold nanoparticles; modifying Probe4 onto the surface of gold nanoparticles; mixing labeled gold nanoparticles with homogeneous reaction solutions. The invention uses the specific recognition of the aptamer, using \T Hg

【技術實現步驟摘要】
一種檢測汞離子的比色生物傳感器及其制備方法
本專利技術涉及生物傳感器
，特別涉及基于核酸適配體檢測汞離子的生物傳感器，還涉及其制備方法。
技術介紹
由于一些重金屬離子的存在對水環境以及人類的健康有著不利的影響，對水生生態系統中的重金屬離子的監測開始受到人們的廣泛重視。汞離子是有毒重金屬污染物，廣泛存在于水，土壤甚至食物中。汞離子可以損傷大腦，心臟，胃，腸和腎臟。微量的汞可以通過食物鏈累積在人體內，造成慢性汞中毒。目前報道的汞離子的檢測方法包括原子發射光譜法、原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質量光譜法，電化學方法等，這些方法往往存在儀器昂貴、分析周期長、樣品預處理復雜、檢測費用昂貴等問題，對于汞離子檢測的方便、快捷、靈敏度等方面的要求已難以適應。因此，目前急需建立一種快速，準確，靈敏且高特異性的檢測方法來檢測汞離子的殘留。
技術實現思路
為了解決以上現有技術中檢測汞離子的方法特異性和靈敏度都比較低、成本高、檢測周期長的問題，本專利技術提供了一種特異性和靈敏度高、成本低、檢測速度快的基于鏈置換以及納米金檢測汞離子的比色生物傳感器。同時，還涉及其制備方法。本專利技術是通過以下步驟得到的：本專利技術中一共用到了4條DNA鏈，其序列分別是：Probe1：5’-GGTCACGCTTTCTTCTTTCTTTC-3’（SEQIDNO:1）；Probe2：5’-GAAAGCGTGACACAG-3’(SEQIDNO:2）；Probe3：5’-GTTTGTTTGTTGTTAGCGTGACGGTC-3’(SEQIDNO:3）；Probe4：5’-SH-TTTCACGCTTTC-3’(SEQIDNO:4）。其中Probe1的斜體部分是Probe2斜體部分的互補序列，在汞離子存在的情況下，Probe3的橫線部分會與Probe1的橫線部分形成“T-Hg2+-T”結構，接著引發Probe3的斜體部分與Probe1斜體部分進行堿基互補配對，釋放Probe2，完成鏈置換過程。同時核酸外切酶Ⅲ水解雙鏈，釋放Probe3繼續重復上述過程，實現信號放大。Probe4的5’端修飾-SH，通過Au-S共價鍵將Probe4修飾到納米金表面，由于Probe4的斜體部分與Probe2的斜體部分進行堿基互補配對，在酶的作用下水解Probe4，釋放Probe2，將金納米粒子間的距離拉近，使得金納米粒子聚沉。釋放的Probe2又可繼續同Probe4雜交實現第二步循環信號放大。通過測量納米金溶液的吸光度來定量檢測汞離子。本專利技術中汞離子的檢測是在均相溶液中實現的，通過鏈置換的方式來實現信號的放大，從而實現汞離子的高靈敏檢測，并獲得較低的檢測下限。均相中發生的反應主要有：Probe1與Probe2進行堿基互補配對。當有汞離子存在時，由于Probe1與Probe3中的堿基T與目標物之間形成“T-Hg2+-T”的特異性復合結構，引發兩條DNA鏈的剩余部分也開始進行堿基互補配對，從而置換出Probe2，同時核酸外切酶Ⅲ水解雙鏈，釋放Probe3繼續重復上述過程，實現信號放大。在均相反應中，反應條件為37℃，反應時間是30min。所述的生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：（1）進行納米金粒子的制備；（2）將Probe4（含-SH）修飾到納米金粒子表面；（3）將標記的納米金溶液與均相反應溶液混合。所述的制備方法，優選納米金粒子的制備操作步驟如下：①安裝好所需儀器，向三口燒瓶中加入200ml超純水（注意不要讓三口燒瓶中落入灰塵）；②取500uL（0.04g/ml）HAuCl4于單個包裝的離心管中，用移液槍取500ul于200ml超純水中，攪拌加熱，攪拌速度450轉左右，至煮沸；③在攪拌的條件下，取3ml1%的檸檬酸三鈉溶液快速加入溶液中，幾分鐘內，溶液顏色由淺黃色變為酒紅色，繼續加熱15min后，撤去熱源，慢慢冷卻至室溫，至于4℃保存備用。④取60ul金納米顆粒溶液于微量比色皿中，使用UV-2600紫外可見分光光度計對其進行光吸收波譜掃描，根據波長在530nm處的摩爾消光系數3.0×109M-1cm-1計算出金納米顆粒溶液的濃度約為0.3nM。所述的制備方法，優選將Probe4（含-SH）修飾到金納米粒子表面的具體操作步驟如下：①取1mL納米金溶液于離心管中，離心10min，同時離心兩管備用。離心至上清液無色透明，去除上清液，加入300μL滅菌水使納米金溶液濃縮至3nM。移入1mL玻璃瓶中，用錫箔紙封口。②室溫放置30min后，加入150μL濃度為30μM的修飾了-SH的底物探針（Probe4），混合均勻后，4℃下放置24h。③分多次緩慢加入50μLPB緩沖液，加入磁子（前一天用王水浸泡）攪拌10min后，繼續加入27μLPBS緩沖液。取出磁子，4℃放置48h。④將標記好的納米金溶液轉移至離心管中，加入滅菌水至1mL，離心10min，去除上清液。再加入1mL滅菌水離心，此過程重復兩次（為了洗脫未標記上的DNA鏈）。該專利技術的檢測方式是納米金比色檢測，利用水解DNA鏈將金納米粒子間距離拉近，使其產生聚沉，從而產生顏色的變化。在檢測之前，先通過Au-S鍵將Probe4修飾到金納米粒子表面。然后將反應后的均相溶液與標有Probe4的納米金粒子混合，在37℃孵育1h完成酶的水解過程。最后，通過檢測溶液的紫外吸收光譜進行目標物的檢測。本專利技術基于核酸適配體與目標物的特異性識別，利用“T-Hg2+-T”的錯配結構實現鏈置換等溫放大特性構建了適體生物傳感器。該傳感器具有檢測速度快，檢測限低，靈敏度高等優點，可以彌補汞離子現有檢測方法的缺陷與不足，實現對其快速，準確的定量檢測。所述的制備方法，優選將標記的納米金溶液與均相反應溶液混合，37℃水浴下反應1h。本專利技術的有益效果：1、利用了核酸適配體的特異型識別，利用“T-Hg2+-T”的特異性結合實現了對目標物汞離子的高特異性檢測；2、利用鏈置換循環放大功能，實現了Probe2和Probe3的循環利用，放大了檢測信號，提高了檢測的靈敏度，實現對目標物汞離子的超靈敏性檢測；3、該傳感器的反應條件溫和，反應速度快；4、由于使用納米金比色法，其檢測方法操作簡便、檢測周期短、易攜帶；5、檢測原理的主要過程均是在均相中實現的，提高了反應速度，降低了操作的復雜程度，實現了目標物的快速，簡單，靈敏的檢測；6、制備方法簡單，性能穩定，納米金比色的重復性好，適用于食品安全及水體中汞離子的檢測和生物傳感器產業化的實際應用；7、制作該生物傳感器的工藝成本低，適用于產業化中價廉的要求。附圖說明圖1為該實驗的原理圖；圖2為實施例1Probe1濃度優化檢測結果圖；圖3為實施例2Probe2濃度優化檢測結果圖；圖4為實施例3Probe3濃度優化檢測結果圖；圖5為實施例4傳感器檢測的標準曲線。具體實施方式下面結合具體實施例對本專利技術進行進一步說明。所述的生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：（1）進行納米金粒子的制備；（2）將Probe4修飾到納米金粒子表面；（3）將標記的納米金溶液與均相反應溶液混合。所述的制備方法，優選納米金粒子的制備操作步驟如下：①安裝好所需儀器，向三口燒瓶中加入200ml超純水（注意不要讓三口燒瓶中落入灰塵）；②取500uL（0.04g/ml）HAuCl4于單個本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測汞離子的比色生物傳感器?，其特征在于，由以下步驟制備而成：（1）納米金粒子的制備；（2）將Probe4修飾到納米金粒子表面；（3）將標記的納米金溶液與均相反應溶液混合；所述Probe4的堿基序列如SEQ?ID?NO：4所示。

【技術特征摘要】
1.一種檢測汞離子的比色生物傳感器，其特征在于，由以下步驟制備而成：（1）納米金粒子的制備；（2）將Probe4修飾到納米金粒子表面；（3）將標記的納米金溶液與均相反應溶液混合；所述Probe4的堿基序列如SEQIDNO：4所示。2.根據權利要求1所述的比色生物傳感器，其特征在于，納米金粒子的制備步驟如下：(1)向三口燒瓶中加入200ml超純水；(2)取500uL，0.04g/mlHAuCl4于單個包裝的離心管中，用移液槍取500ul于三口燒瓶中，攪拌加熱，攪拌速度450轉左右，至煮沸；(3)在攪拌的條件下，取3ml1%的檸檬酸三鈉溶液快速加入溶液中，幾分鐘內，溶液顏色由淺黃色變為酒紅色，繼續加熱15min后，撤去熱源，慢慢冷卻至室溫，置于4℃保存備用。3.根據權利要求1所述的比色生物傳感器，其特征在于，將Probe4修飾到納米金粒子表面的具體操作步驟如下：(1)取1mL納米金溶液于離心管中，離心10min，同時離心兩管備用；離心至上清液無色透明，去除上清液，加入300μL滅菌水使納米金溶液濃縮至3nM；移入1mL玻璃瓶中，用錫箔紙封口；(2)室溫放置30min后，加入150μL濃度...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李慧，韓聰，宋曉蕾，劉素，王玉，黃加棟，裴倩倩，冷雪琪，崔雪珺，張雪，王敬鋒，王海旺，
申請(專利權)人：濟南大學，
類型：發明
國別省市：山東,37