一種用于檢測ApoM啟動子基因序列的引物對及其檢測方法和試劑盒技術

本發明專利技術公開了一種用于檢測ApoM啟動子基因序列的引物對及其檢測方法和試劑盒，所述引物對是SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示的核苷酸序列，所述引物對用于檢測ApoM基因啟動子區rs805396和?724兩個位點。所述檢測方法包括提取基因組DNA,設計引物對，以全基因組為模板進行PCR擴增，回收PCR擴增產物并純化；對純化后的PCR擴增產物進行測序，分析測序結果并判斷是否發生突變。該檢測方法設計巧妙、操作簡單、檢測結果可靠準確，根據檢測方法設計出的相關試劑盒使用簡便可行。

Primer pair for detecting ApoM promoter gene sequence, detection method and kit thereof

The invention discloses a method for detecting ApoM gene promoter sequence primer detection method and kit thereof, wherein the nucleotide sequence of SEQ primer pairs is ID NO:1 and SEQ ID as shown in NO:2, the primers to start rs805396 and sub region for the detection of ApoM gene of 724 two bit point. The detection method includes extracting genomic DNA, design primers, using the whole genome as template for PCR amplification, recovery and purification of PCR products; the purified PCR amplification products were sequenced. Sequence analysis results and determine whether the mutation. The detection method has the advantages of artful design, simple operation and reliable and accurate detection result. The relevant reagent box designed according to the detection method is simple and feasible to use.

【技術實現步驟摘要】
一種用于檢測ApoM啟動子基因序列的引物對及其檢測方法和試劑盒
本專利技術屬于基因相關位點檢測
，具體涉及一種用于檢測ApoM啟動子基因序列的引物對及其檢測方法和試劑盒。
技術介紹
目前全世界糖尿病患者的數量已達3.66億，全球每7秒種就有一人死于糖尿病。糖尿病是指以血糖增高為主要臨床表現的慢性代謝性疾病，主要分為1型糖尿病和2型糖尿病，2型糖尿病占糖尿病患者90％以上。1型糖尿病是一種自體免疫疾病，是由于免疫系統對分泌胰島素的胰腺β細胞作出攻擊導致胰腺不能分泌足夠的胰島素。而2型糖尿病是由于各種致病因素導致組織器官產生胰島素抵抗，即胰島素相對缺乏，故通常臨床上用胰島素釋放實驗來區別糖尿病的類型?；颊咴囼灴崭辜斑M食75克葡萄糖后30分鐘、60分鐘、120分鐘和180分鐘分別抽血測定胰島素及C肽水平。若空腹胰島素及C肽低于正常，且進食后不增高考慮為1型糖尿病；若空腹胰島素及C肽低于正常、增高或降低，且進食后增高，則考慮為2型糖尿病。2型糖尿病具體的致病原因仍然未知，現在的研究發現其是由遺傳因素和環境因素共同作用導致的，其中遺傳因素約占30％,環境因素約占70％。2型糖尿病的遺傳風險是由多個基因共同決定的，目前為止,公認的2型糖尿病易感基因已經增至20個,同時還發現了13個影響空腹血糖的基因以及5個影響餐后血糖的基因。臨床常規檢查例如空腹及餐后血糖、糖化血紅蛋白、C肽水平只能判斷2型糖尿病的發生發展情況，但無法找到致病根源，無法根據這些指標做出及時的預防和根本性的治療，而基因檢測通過對2型糖尿病相關易感基因進行檢查，能夠準確的發現致病基因，準確率達到99.9999％，真正做到快速診斷疾病，發現致病根源，提前預知2型糖尿病發病風險，可通過調節飲食結構和生活方式，有效的控制疾病的發生與發展，防止并發癥，還具有縮短檢查流程，提升檢查準確性，精確藥物用量，減少藥物毒副作用，提高藥物治療效果等一系列的優勢。對此，我們應該盡量多發現和研究一些與2型糖尿病相關的基因易感性位點，做到有病先來防，有病正確對待并及早調整和治療。
技術實現思路
本專利技術旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本專利技術提供一種用于檢測ApoM啟動子基因序列的引物對及其檢測方法和試劑盒，該檢測方法設計巧妙、操作簡單、檢測結果可靠準確，試劑盒使用簡便可行，為后續的檢測手段以及進一步采取有針對性的健康管理、疾病預防提供參考依據。為了實現上述目的，本專利技術采取的技術方案為：一種引物對，所述引物對是SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，所述引物對用于檢測ApoM基因啟動子區rs805396和-724兩個位點。一種用于檢測ApoM啟動子基因序列相關位點的檢測方法，包括如下步驟：A、提取全基因組DNA；B、根據ApoM啟動子基因序列及位點設計引物對，對提取的全基因組DNA進行PCR擴增，回收PCR產物并割膠純化；C、對純化后的PCR產物進行測序，并分析測序結果來判斷ApoM啟動子基因是否發生突變。一種用于檢測ApoM啟動子基因序列的試劑盒，所述試劑盒內包括基因組DNA抽提試劑盒、PCR擴增產物純化試劑盒、PCR反應試劑盒、BigDye測序反應試劑盒、無水乙醇試劑瓶和盛放引物對的容器。所述試劑盒內還設有控溫裝置。所述試劑盒內設有托架，所述托架設有六個凹槽容納腔，六個凹槽容納腔內分別放置所述基因組DNA抽提試劑盒、PCR擴增產物純化試劑盒、PCR反應試劑盒、BigDye測序反應試劑盒、無水乙醇試劑瓶和盛放引物對的容器。所述凹槽容納腔的內周向側壁設有緩沖結構。所述試劑盒包括盒體和蓋合在盒體上的盒蓋，所述盒蓋與盒體鉸接。所述盒體與盒蓋的蓋合處設有密封墊。本專利技術的有益效果：本專利技術首次發現了ApoM基因的啟動子區-724位點是2型糖尿病相關位點，與已知的rs805396位置相近，設計特異性的一對引物，以來自人的組織、全血樣本提取全基因組DNA模板進行PCR擴增，并對擴增產物進行測序，該檢測方法設計巧妙、操作簡單、檢測結果可靠準確，根據檢測方法設計出的相關試劑盒使用簡便可行。使用本試劑盒檢測這兩個相關位點，并根據這兩個相關位點的具體狀況作為2型糖尿病健康管理的主線，監控疾病的發生發展。如果是2型糖尿病遺傳傾向較高的人群，及時預防2型糖尿病的外在致病因素，并按時完善預防性的相關的檢查，例如空腹、餐后血糖，做到及早預防，早發現，早治療甚至避免疾病的發生。通過本專利技術試劑盒的設計，便于放置實施檢測方法過程中所使用的試劑，更利于檢測試驗的進行，試劑盒內控溫裝置的設置，便于使試劑盒在運輸過程，或者取出試劑做實驗過程中保持試劑盒中的試劑基本維持在實驗所需要的溫度。緩沖結構的設置，使放置物能夠較好的固定在凹槽容納腔內，在運輸過程中不易晃動，使試劑盒在移動過程中不會造成凹槽容納腔內放置物易破損情況的發生。附圖說明本說明書包括以下附圖，所示內容分別是：圖1是本專利技術試劑盒的結構示意圖。圖中標記為：1、基因組DNA抽提試劑盒，2、PCR擴增產物純化試劑盒，3、PCR反應試劑盒，4、BigDye測序反應試劑盒，5、無水乙醇試劑瓶，6、盛放引物對的容器，7、控溫裝置。具體實施方式下面對照附圖，通過對實施例的描述，對本專利技術的具體實施方式作進一步詳細的說明，目的是幫助本領域的技術人員對本專利技術的構思、技術方案有更完整、準確和深入的理解，并有助于其實施。1.基因組DNA提取:1.1試劑和儀器:1.1.1試劑和耗材：基因組DNA抽提試劑盒(TIANampBLOODDNAkit,DP318-03；TIANamp口腔拭子基因組DNA提取試劑盒，DP322-03)含:細胞裂解液CL；緩沖液GA；緩沖液GS；緩沖液GB；緩沖液GD；漂洗液PW；洗脫緩沖液TB；CarrierRNA；RNase-freeddH2O；蛋白酶K(20mg/ml)；吸附柱；收集管(2ML)；1.5ML無菌收集管；無水乙醇。1.1.2儀器:BECKMANCOULTER20R離心機；QilinbeierVORTEX-5旋渦混合器；HH-W600電熱恒溫水浴鍋。1.2提取步驟從全血中提取基因組DNA1.2.1取200u1的抗凝全血至1.5m1的Eppendorf管中，如果樣本的量少于200u1，則加入緩沖液GS補充至200u1。如果樣本量多于200u1，需要用細胞裂解液CL處理，具體步驟如下：在樣品中加入1-2.5倍體積的細胞裂解液CL,顛倒混勻，10000rpm離心1分鐘，吸取上清，留下細胞核沉淀(如果裂解不徹底，可重復以上步驟一次)，向離心收集到的細胞核沉淀中加200u1緩沖液GS，振蕩至徹底混勻。1.2.2加入20u1的蛋白酶K溶液，混勻，再加入200u的緩沖液GB，立刻充分顛倒混勻。56℃水浴樣本10分鐘，水浴過程中請每隔3分鐘上下輕柔顛倒混勻樣本，溶液應變清亮。(如溶液未徹底變清亮，可延長裂解時間至溶液變清亮為止)。1.2.3加入200u1無水乙醇，充分顛倒混勻，這時可能會出現絮狀沉淀。1.2.4將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(～13,400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。1.2.5向吸附柱中加入500ul緩沖液GD(使用前請本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種引物對，所述引物對是SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示的核苷酸序列，其特征在于：所述引物對用于檢測ApoM基因啟動子區rs805396和?724兩個位點。

【技術特征摘要】
1.一種引物對，所述引物對是SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，其特征在于：所述引物對用于檢測ApoM基因啟動子區rs805396和-724兩個位點。2.一種用于檢測ApoM啟動子基因序列相關位點的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：A、提取全基因組DNA；B、根據ApoM啟動子基因序列及位點設計引物對，對提取的全基因組DNA進行PCR擴增，回收PCR產物并割膠純化；C、對純化后的PCR產物進行測序，并分析測序結果來判斷ApoM啟動子基因是否發生突變。3.一種用于檢測ApoM啟動子基因序列的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒內包括基因組DNA抽提試劑盒、PCR擴增產物純化試劑盒、PCR反應試劑盒、BigDye測序反應試劑盒、無水乙醇試劑瓶和盛放引物對的容器。4.根據權利要求3所述用于檢...

【專利技術屬性】
技術研發人員：章堯，張普宏，高家林，孟宇，王李卓，呂俊，
申請(專利權)人：皖南醫學院，
類型：發明
國別省市：安徽,34