檢測寨卡病毒的引物、試劑盒和方法技術

本發明專利技術公開了檢測寨卡病毒的引物、試劑盒以及方法，所述引物包括有序列組成為SEQ?ID.NO.1?SEQ?ID.NO.2的內引物，序列組成為SEQ?ID.NO.3?SEQ?ID.NO.4的外引物，還具有序列組成為SEQ?ID.NO.5?SEQ?ID.NO.6的環引物。本發明專利技術所述試劑盒具有檢測寨卡病毒靈敏度高，特異性強，且檢測快速的優點。

Primer, reagent kit and method for detecting stockade virus

The invention discloses a primer, kit and detection method of Zika virus, the primers include a sequence composed of inner primers SEQ ID.NO.1 SEQ ID.NO.2, composed of outer primers sequence SEQ ID.NO.3 SEQ ID.NO.4, also has a sequence composed of ring SEQ ID.NO.5 SEQ primer ID.NO.6. The reagent box of the invention has the advantages of high sensitivity, strong specificity and rapid detection of the Zhai virus.

【技術實現步驟摘要】
檢測寨卡病毒的引物、試劑盒和方法
本專利技術屬于生物技術，具體是涉及一種檢測寨卡病毒的引物、試劑盒和方法。
技術介紹
寨卡(Zika)病毒主要通過埃及伊蚊叮咬傳播，患者、隱性感染者和感染寨卡病毒的非人靈長類動物是該病的傳染源。寨卡病毒疫情通過蚊蟲叮咬傳播，感染后癥狀與登革熱相似，包括發燒、疹子、關節疼痛、肌肉疼痛、頭痛和結膜炎(紅眼)。寨卡病毒感染者中，只有約20％會表現輕微癥狀，如發燒、皮疹、關節疼痛和結膜炎等，癥狀通常不到一周即可消失。然而，如果孕婦感染，胎兒可能會受到影響，導致新生兒小頭癥甚至死亡。有研究發現寨卡病毒也可以通過母嬰途徑傳播，包括胎兒宮內感染或者在分娩過程中受到感染，有報道發現在乳汁中可以檢測到寨卡病毒的核酸。目前，全球超過150萬人感染寨卡病毒，中國感染人數較少，但感染人數不斷增加，寨卡病毒感染已成為威脅人類健康的一個嚴重的全球性公共衛生問題。寨卡病毒感染一年四季均可發病，也可存在某個地區或者季節蚊蟲孳生繁殖快而導致爆發感染的可能。我們需要予以重視，并且要研發一種快速、準確的方法用作其檢測方法。寨卡病毒的核酸是由三個結構基因和五個非結構基因組成，具有10,794個核苷酸的ss(+)RNA基因組。寨卡病毒有原型MR766和ZIKAEC2007兩個全基因組序列在GenBank中公開，它們的序列具有89％的同源性，具有97％的氨基酸相似性。環介導恒溫擴增技術(Real-timeloopmediatedisothermalamplification，Real-timeLAMP)是21世紀初期研發的一種新技術，是一項適用于基因診斷的恒溫核酸擴增技術，針對靶序列上6或8個特異區域設計4或6條特異引物，在鏈置換BstDNA聚合酶下快速擴增目的片段，擴增時間只需60min。目前，環介導等溫擴增技術已廣泛應用于國內外各種病毒、細菌、寄生蟲等引起的疾病檢測、食品化妝品安全檢查及進出口快速診斷中。實時熒光LAMP技術是LAMP技術的優化，該技術可直接用臨床血液樣本提取核酸，然后便可進行擴增，與傳統的檢測技術相比，該技術的優勢除了高特異性、高靈敏度外，操作簡單、快速，對儀器設備要求低，一臺水浴鍋或恒溫箱就能實現反應，通過檢測熒光信號強弱可判斷檢測結果，適用于對疾病的快速診斷。將其用于寨卡病毒的快速診斷，可大大地縮短檢驗報告時間，更加快速地提供診斷寨卡病毒感染的依據，而后及時給予患者適當的治療，以免耽誤病程。Rea-LAMP作為一種擴增基因的檢測技術，也有其缺陷，例如氣溶膠的污染是不可避免的，這也是導致Rea-LAMP出現假陽性的主要原因；Rea-LAMP比PCR通用性差，Rea-LAMP主要用作診斷或檢測技術，不用于克隆目的；Rea-LAMP反應體系加入中引物數量較多，增加了引物與引物之間的相互作用，例如形成二聚體機會增加；Rea-LAMP檢測技術不如PCR成熟。到目前為止，尚未有研究對Real-timeLAMP檢測寨卡病毒進行系統的評價與分析。為檢測寨卡病毒提供新的檢測技術，我們試行運用Real-timeLAMP技術檢測寨卡病毒，尋找高特異性的檢測寨卡(Zika)病毒的Real-timeLAMP試劑盒。
技術實現思路
本專利技術的目的之一是提供一種檢測寨卡(Zika)病毒的試劑盒，該試劑盒具有靈敏度高、特異性強的優點。實現上述目的的技術方案如下。一種檢測寨卡病毒的試劑盒，包括有序列組成為SEQID.NO.1-SEQID.NO.2的內引物，序列組成為SEQID.NO.3-SEQID.NO.4的外引物。在其中一個實施例中，還包括有序列組成為SEQID.NO.5-SEQID.NO.6的環引物。在其中一個實施例中，在檢測體系中，所述內引物的濃度為40±0.5μM、所述環引物的濃度為20±0.5μM、所述外引物的濃度為5±0.5μM。本專利技術的另一個目的是提供一種檢測寨卡病毒的引物。實現上述目的的技術方案如下。一種檢測寨卡病毒的引物，包括有序列組成為SEQID.NO.1-2的內引物，序列組成為SEQID.NO.3-4的外引物。在其中一個實施例中，還包括有序列組成為SEQID.NO.5-6的環引物。本專利技術的另一個目的是提供一種檢測寨卡病毒的方法。實現上述目的的技術方案如下。一種檢測寨卡病毒的方法，采用上述檢測試劑盒，包括以下步驟：(1)提取待檢測樣品的基因組；(2)配置引物和反應體系，進行環介導恒溫擴增；(3)檢測擴增產物。在其中一個實施例中，在反應體系中，所述內引物的濃度為40±0.5μM、所述環引物的濃度為20±0.5μM、所述外引物的濃度為5±0.5μM。本專利技術具有以下有益效果：本專利技術經過專利技術人精心篩選到的一套針對檢測寨卡病毒RNA的引物，選取8株常見病原菌做陰性對照，結果顯示均為陰性，只有寨卡病毒出現典型的陽性結果，顯示特異性強；且檢測寨卡病毒RNA的靈敏度較高，可達3.3ng/μl。進一步地，本專利技術所篩選到的引物，因為還具有特異性的環引物，除有特異性強，靈敏度高的優點之外，還具有檢測時間短，陽性結果可在35min內檢測完成的優點。本專利技術所述的檢測試劑盒可用于寨卡病毒感染的早期診斷。附圖說明圖1NS5-1加環引物的引物篩選試驗(上)及其溶解曲線(下)；圖2NS5-2加環引物的引物篩選試驗(上)及其溶解曲線(下)；圖3NS5-3加環引物的引物篩選試驗(上)及其溶解曲線(下)；圖4NS5-4加環引物的引物篩選試驗(上)及其溶解曲線(下)；圖5NS5-1不加環引物的引物篩選試驗(上)及其溶解曲線(下)；圖6NS5-2不加環引物的引物篩選試驗(上)及其溶解曲線(下)；圖7NS5-3不加環引物的引物篩選試驗(上)及其溶解曲線(下)；圖8NS5-4不加環引物的引物篩選試驗(上)及其溶解曲線(下)；圖9Rea-LAMP檢測NS5基因的特異性結果示意圖；圖10Rea-LAMP檢測NS5的靈敏度試驗結果示意圖；圖11Rea-LAMP檢測NS5的重復性試驗結果示意圖。具體實施方式為了便于理解本專利技術，下面將對本專利技術進行更全面的描述。本專利技術可以以許多不同的形式來實現，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本專利技術的公開內容的理解更加透徹全面。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所用到的各種常用化學試劑，均為市售產品。除非另有定義，本專利技術所使用的所有的技術和科學術語與屬于本專利技術的
的技術人員通常理解的含義相同。本專利技術的說明書中所使用的術語只是為了描述具體的實施例的目的，不用于限制本專利技術。本專利技術所使用的術語“和/或”包括一個或多個相關的所列項目的任意的和所有的組合。實施例11.1材料1.1.1病毒核酸或菌株來源病毒核酸購自北京市普瑞麥迪實驗室有限公司。另選取常見的病原菌作為對照菌，包括銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、草綠色鏈球菌、陰溝腸桿菌、肺炎鏈球菌，均為廣州醫科大學附屬第三醫院檢驗科微生物室分離菌株，于-20℃保存。1.1.2DNA提取試劑及儀器設備細菌基因本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測寨卡病毒的試劑盒，其特征在于，包括有序列組成為SEQID.NO.1?SEQID.NO.2的內引物，序列組成為SEQID.NO.3?SEQID.NO.4的外引物。

【技術特征摘要】
1.一種檢測寨卡病毒的試劑盒，其特征在于，包括有序列組成為SEQID.NO.1-SEQID.NO.2的內引物，序列組成為SEQID.NO.3-SEQID.NO.4的外引物。2.根據權利要求1所述的檢測寨卡病毒的試劑盒，其特征在于，還包括有序列組成為SEQID.NO.5-SEQID.NO.6的環引物。3.根據權利要求1或2所述的檢測寨卡病毒的試劑盒，其特征在于，在檢測時，所述內引物的濃度為40±0.5μM、所述環引物的濃度為20±0.5μM、所述外引物的濃度為5±0.5μM。4.一種檢測寨卡病毒的引物，其特征在于，包括有序列組成為SEQID.NO.1-SEQID.NO.2的內引物，序列組成為SEQID.NO.3-SEQID.NO.4的外...

【專利技術屬性】
技術研發人員：郭旭光，周永焯，夏勇，
申請(專利權)人：廣州醫科大學附屬第三醫院，
類型：發明
國別省市：廣東,44