肉芝軟珊瑚提取物的生物活性SRB測(cè)定方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種肉芝軟珊瑚提取物的生物活性SRB測(cè)定方法，步驟如下：(1)取對(duì)數(shù)期的腫瘤細(xì)胞，每孔200μL加入96孔板中，每孔加入不同濃度的樣品溶液2μL；(2)37oC培養(yǎng)17h；(3)離心吸去上清；(4)每孔加入50μL預(yù)冷的80%TCA溶液，移入4oC冰箱中固定1.5h，再用去離子水沖洗5次，室溫晾干；(5)每孔加入0.5%SRB染液50μL，室溫靜置30min后，用預(yù)冷的1%TCA水溶液沖洗4次，室溫晾干；(6)每孔加入150μL?Tris溶液溶解與蛋白結(jié)合的染料，用酶標(biāo)儀在520nm下測(cè)定每孔吸光度OD值。按公式IR(%)=(OD

Method for determination of biological activity of SRB Sarcophyton extract

Method for determination of biological activity of SRB, the present invention relates to a soft coral extract comprises the following steps: (1) the logarithm period of tumor cells, each hole of 200 L with 96 well plates, each hole sample solution with different concentrations of 2 L; (2) 37 degrees C culture 17h; (3) centrifuge suction to clear; (4) per hole adding 80%TCA solution 50 L pre cooled, 4 degree C 1.5h fixed into the refrigerator, and then rinse with deionized water 5 times and dried at room temperature; (5) per hole adding 0.5%SRB dye 50 L, room temperature for 30min after washing 4 times, with the room temperature dry 1%TCA water solution precooling; (6) 150 L per hole adding Tris solution and protein binding dye, measured per hole absorbance od in 520nm using elisa. By formula IR (%) = (OD

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
肉芝軟珊瑚提取物的生物活性SRB測(cè)定方法
本專利技術(shù)屬于海洋生物醫(yī)藥
，具體涉及一種肉芝軟珊瑚提取物的生物活性SRB測(cè)定方法。
技術(shù)介紹
肉芝軟珊瑚(Sarcophytonsp.)，分類學(xué)上屬腔腸動(dòng)物門(Cnidaria)，珊瑚蟲綱(Anthozoa)，軟珊瑚目動(dòng)物(Alcyonacea)，軟珊瑚科(Alcyoniidae)，肉芝軟珊瑚屬(Sarcophyton)動(dòng)物，是一種在熱帶與亞熱帶比較常見(jiàn)的海洋生物。肉芝軟珊瑚顏色多種，包括褐色、綠色或棕色，帶有白色或金色的水螅體，隨著生長(zhǎng)會(huì)長(zhǎng)出褶皺。珊瑚體呈平鋪的盆形，群體肥厚，中央凹入，表面常具有略呈輻射狀的脊，脊寬約1至3公分；群體的柱部低矮、粗大。全球有肉芝軟珊瑚約41種，到目前為止，國(guó)內(nèi)外研究者已對(duì)該屬的17個(gè)種開(kāi)展了化學(xué)成分研究。該屬的化學(xué)成分主要有萜類(包括倍半萜、二萜、三萜、四萜，尤其以西松烷二萜居多)、甾醇(尤其以多羥基甾醇居多)、糖苷類、前列腺素、神經(jīng)酰胺、吡啶衍生物及脂肪酸等化合物。這其中不乏許多結(jié)構(gòu)新穎、生理活性顯著的化學(xué)成分，因此我們選擇南海肉芝軟珊瑚(Sarcophytonsp.)進(jìn)行化學(xué)成分及其生物活性的研究。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)旨在為肉芝軟珊瑚的提取物提供一種方便可靠的生物活性測(cè)定方法。一種肉芝軟珊瑚提取物的生物活性SRB測(cè)定方法，步驟如下：(1)取對(duì)數(shù)期的腫瘤細(xì)胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度為2×105個(gè)/ml，每孔200μL加入96孔板中，每孔加入不同濃度的樣品溶液2μL；(2)37oC培養(yǎng)17h；(3)離心3min(4oC、3000prm)，吸去上清；(4)每孔加入50μL預(yù)冷的80%TCA溶液，移入4oC冰箱中固定1.5h，再用去離子水沖洗5次，室溫晾干；(5)每孔加入0.5%SRB染液(1%的TCA溶液)50μL，室溫靜置30min后，用預(yù)冷的1%TCA水溶液沖洗4次，去除未結(jié)合的染料，室溫晾干；(6)每孔加入150μL非緩沖Tris溶液溶解(10mM，pH=10.5)與蛋白結(jié)合的染料，用酶標(biāo)儀在520nm下測(cè)定每孔吸光度OD值。在96孔板中每個(gè)樣品濃度設(shè)3孔，另設(shè)空白對(duì)照3孔，取3孔平均值，按公式IR(%)=(OD空白-OD樣品)/OD空白×100%計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(IR%)，再利用Bliss方法由各種濃度的IR求出半數(shù)抑制濃度(IC50)的標(biāo)準(zhǔn)差和平均值。本專利技術(shù)的測(cè)定原理：磺酰羅丹明B(SulforhodamineB，SRB)比色法，主要用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。SRB是一種粉紅色陰離子染料，易溶于水，在酸性條件下可特異性地與細(xì)胞內(nèi)組成蛋白質(zhì)的堿性氨基酸結(jié)合；在520nm波長(zhǎng)下產(chǎn)生吸收峰，吸光值與細(xì)胞量成線性正相關(guān)，故可用作細(xì)胞數(shù)的定量檢測(cè)。本專利技術(shù)的測(cè)定方法相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)簡(jiǎn)單快速、而且檢測(cè)結(jié)果可靠，適于推廣應(yīng)用。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本專利技術(shù)做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。選擇HeLa腫瘤細(xì)胞株用SRB法對(duì)從肉芝軟珊瑚分離得到的多羥基甾醇SAR1-SAR11進(jìn)行體外抗腫瘤活性篩選，包括如下步驟：(1)取對(duì)數(shù)期的腫瘤細(xì)胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度為2×105個(gè)/ml，每孔200μL加入96孔板中，每孔加入不同濃度的樣品溶液2μL；(2)37oC培養(yǎng)17h；(3)離心3min(4oC、3000prm)，吸去上清；(4)每孔加入50μL預(yù)冷的80%TCA溶液，移入4oC冰箱中固定1.5h，再用去離子水沖洗5次，室溫晾干；(5)每孔加入0.5%SRB染液(1%的TCA溶液)50μL，室溫靜置30min后，用預(yù)冷的1%TCA水溶液沖洗4次，去除未結(jié)合的染料，室溫晾干；(6)每孔加入150μL非緩沖Tris溶液溶解(10mM，pH=10.5)與蛋白結(jié)合的染料，用酶標(biāo)儀在520nm下測(cè)定每孔吸光度OD值。在96孔板中每個(gè)樣品濃度設(shè)3孔，另設(shè)空白對(duì)照3孔，取3孔平均值，按公式IR(%)=(OD空白-OD樣品)/OD空白×100%計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(IR%)，再利用Bliss方法由各種濃度的IR求出半數(shù)抑制濃度(IC50)的標(biāo)準(zhǔn)差和平均值。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，分析表中數(shù)據(jù)可以看出在濃度為50μM濃度水平，化合物SAR3、6、9對(duì)HeLa細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，SAR1、2、7表現(xiàn)出中等的細(xì)胞毒活性，其中化合物SAR4、10對(duì)HeLa細(xì)胞無(wú)抑制活性。表1多羥基甾醇化合物SAR1-SAR11對(duì)Hela腫瘤細(xì)胞株的抑制率(%)本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種肉芝軟珊瑚提取物的生物活性SRB測(cè)定方法，其特征在于，步驟如下：(1)取對(duì)數(shù)期的腫瘤細(xì)胞，用新鮮的RPMI?1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度為2×10

【技術(shù)特征摘要】
1.一種肉芝軟珊瑚提取物的生物活性SRB測(cè)定方法，其特征在于，步驟如下：(1)取對(duì)數(shù)期的腫瘤細(xì)胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度為2×105個(gè)/ml，每孔200μL加入96孔板中，每孔加入不同濃度的樣品溶液2μL；(2)37oC培養(yǎng)17h；(3)離心3min(4oC、3000prm)，吸去上清；(4)每孔加入50μL預(yù)冷的80%TCA溶液，移入4oC冰箱中固定1.5h，再用去離子水沖洗5次，室溫晾干；(5)每孔加入0.5%SRB染液(1%的TCA...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：褚方強(qiáng)，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：青島清泉生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：山東,37