一種檢測并鑒定隱球菌的靶基因、引物和探針及試劑盒制造技術

本發明專利技術公開了一種檢測并鑒定隱球菌的靶基因、引物和探針及試劑盒，屬于醫學真菌學的領域。根據隱球菌的靶基因，設計該檢測隱球菌基因的引物序列如SEQ?ID?No.3與SEQ?ID?No.4和/或SEQ?ID?No.6與SEQ?ID?No.7所示，其中SEQ?ID?No.3與SEQ?ID?No.4對應于新生隱球菌，SEQ?ID?No.6與SEQ?ID?No.7對應于格特隱球菌，可以用于特異性檢測兩種隱球菌。基于熒光定量PCR原理，本發明專利技術還提供了一組檢測新生隱球菌和/或格特隱球菌的探針，以及基于引物和探針的檢測試劑盒，可在同一體系同時或者分別檢測并鑒定兩種致病性隱球菌：新生隱球菌與格特隱球菌。具有敏感性高、特異性強、重復性好、檢測時間短的優點。

A target gene, primer, probe and kit for detecting and identifying Cryptococcus

The invention discloses a target gene, primer and probe and kit for detection and identification of Cryptococcus, belonging to the field of medical mycology. According to the target gene of Cryptococcus neoformans, design the detection of primer sequences of genes such as SEQ No.3 and SEQ ID ID No.4 and / or SEQ ID No.6 and SEQ ID No.7 shows, including SEQ No.3 and SEQ ID ID No.4 corresponding to Cryptococcus neoformans, SEQ ID No.6 and SEQ ID Hugh No.7 corresponding special Cryptococcus, can be used for specific detection of two kinds of Cryptococcus neoformans. Fluorescence quantitative PCR based on the principle of the invention also provides a set of probe detection of Cryptococcus neoformans and / or Cryptococcus neoformans, and based on the detection kit of primer and probe, can be in the same system simultaneously or separately the detection and identification of two pathogenic Cryptococcus: Cryptococcus neoformans and Cryptococcus neoformans. The utility model has the advantages of high sensitivity, strong specificity, good repeatability and short detection time.

【技術實現步驟摘要】
一種檢測并鑒定隱球菌的靶基因、引物和探針及試劑盒
本專利技術屬于醫學真菌學的領域，具體涉及用于隱球菌特定靶基因檢測的引物和探針及試劑盒。
技術介紹
目前隱球菌屬的種類較多，在自然界分布廣泛，與人類感染最密切的主要有新生隱球菌和格特隱球菌，他們均可導致人類肺部或中樞神經系統隱球菌病，也可致全身播散性感染。格特隱球菌曾引起加拿大溫哥華地區及美國西北部地區爆發流行，近年來歐洲和我國也有感染病例報告，在我國，格特隱球菌主要分布在上海、江蘇、福建、浙江、廣東、海南、河北等省份，新生隱球菌各地均有散發病例。新生隱球菌主要感染免疫缺陷患者，格特隱球菌則主要引起免疫正常人群患病。一般認為，格特隱球菌致病性和耐藥性均高于新生隱球菌。由于隱球菌感染后的臨床表現不典型，容易誤診為細菌性感染，病原學檢測成為診斷和治療的依據。盡管腦脊液墨汁染色可以初步觀察隱球菌的形態，但敏感性低；隱球菌抗原試劑可以快速檢測隱球菌抗原，但不能區分兩種主要的致病性隱球菌；隱球菌培養鑒定不僅需時較長，而且多數自動化鑒定儀難以鑒定新生隱球菌和格特隱球菌，導致實驗室只能報告隱球菌，或有可能錯誤地將格特隱球菌報告為新生隱球菌。正確檢測并鑒定新生隱球菌和格特隱球菌有賴于新的技術和方法。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種用于隱球菌特異性檢測的靶基因，能夠作為檢測靶標準確檢測并鑒別出兩種重要的致病性隱球菌而不會被誤診為細菌。本專利技術的另一個目的是基于該特異性靶基因位置而設計的檢測引物和探針，準確鑒別出新生隱球菌與格特隱球菌兩種不同的致病性隱球菌類型。本專利技術的又一目的是提供一種快速檢測試劑盒，能夠方便快捷地檢測并鑒定新生隱球菌與格特隱球菌。為了實現上述目的，本專利技術技術方案如下：本專利技術提供一種檢測隱球菌的特定靶基因，靶基因序列如SEQIDNo.1和/或SEQIDNo.2所示，其中SEQIDNo.1對應于新生隱球菌，SEQIDNo.2對應于格特隱球菌，特定靶基因序列應用于制備隱球菌檢測試劑。用于檢測新生隱球菌的引物和探針，以SEQIDNo.1所示核苷酸序列為模板設計，以SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示核苷酸序列為引物，以SEQIDNo.5所示核苷酸序列為探針，具體序列如下：上游引物CN2F(5’-cttactcggcacaactccac-3’)：SEQIDNo.3；下游引物CN2R(5’cggtgaatcaaatgacgtacctc-3’)：SEQIDNo.4；探針CN2P(HEX-ccaccgatcacacatccacgtgctc-BHQ1)：SEQIDNo.5；其中探針序列的5’端標記熒光報告基團，3’端標記淬滅基團。用于檢測新生隱球菌的試劑盒，包括用于檢測新生隱球菌的引物CN2F、CN2R和探針CN2P，還包括緩沖液、MgCl2、dNTPs、TaqDNA聚合酶等。用于檢測格特隱球菌的引物和探針，以SEQIDNo.2所示核苷酸序列為模板設計，以SEQIDNo.6和SEQIDNo.7所示核苷酸序列為引物，以SEQIDNo.8所示核苷酸序列為探針，具體序列如下：上游引物CG3F(5’-atcaccttcacccaggagaa-3’)：SEQIDNo.6；下游引物CG3R(5’-ggaaatcaaacgacttacg-3’)：SEQIDNo.7；探針CG2P(FAM-aggagaaggagggtgctcccgttac-BHQ1)：SEQIDNo.8；其中探針序列的5’端標記熒光報告基團，3’端標記淬滅基團。用于檢測格特隱球菌的試劑盒，包括用于檢測格特隱球菌的引物CG3F、CG3R和探針CG2P，還包括緩沖液、MgCl2、dNTPs、TaqDNA聚合酶等。用于檢測隱球菌的試劑盒，能夠同時檢測新生隱球菌和格特隱球菌，包括用于檢測新生隱球菌的引物CN2F、CN2R和探針CN2P，還包括用于檢測格特隱球菌的引物CG3F、CG3R和探針CG2P，還包括緩沖液、MgCl2、dNTPs、TaqDNA聚合酶等。與現有技術相比，本專利技術具有以下有益效果：本專利技術關鍵在于特異性靶基因位置的選擇及引物和探針的設計。實驗證實，使用所設計的引物和探針檢測并鑒定新生隱球菌和格特隱球菌的特異性和敏感性均較好。本專利技術通過比對新生隱球菌和格特隱球菌不同基因型之間及其與其他真菌基因的序列差異，選擇銅鋅超氧化物歧化酶部位的序列片段作為靶基因，設計出引物和探針，使對新生隱球菌和格特隱球菌進行檢測和鑒定過程中的敏感性高、特異性強。檢測時間短，本專利技術將檢測新生隱球菌和格特隱球菌時所需的原料放在同一反應體系內，可分別檢測并鑒定新生隱球菌和格特隱球菌，亦可同時檢測，明確病原菌種類，使對新生隱球菌和格特隱球菌進行檢測和鑒定的時間大大縮短，幫助臨床診斷，贏得治療時間。附圖說明圖1示所述新生隱球菌在不同濃度DNA(500ng，50ng，5ng，0.5ng)的擴增曲線；圖2示所述格特隱球菌在不同濃度DNA(500ng，50ng，5ng，0.5ng)的擴增曲線；圖3示所述新生隱球菌的特異性擴增曲線，平行試驗檢測大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，肺炎鏈球菌，B族鏈球菌，流感嗜血桿菌，結核分枝桿菌及光滑念珠菌，釀酒酵母菌，阿薩希毛孢子菌，結果均為陰性(基線下方的曲線)；圖4示所述格特隱球菌的特異性擴增曲線，平行試驗檢測大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，肺炎鏈球菌，B族鏈球菌，流感嗜血桿菌，結核分枝桿菌及光滑念珠菌，釀酒酵母菌，阿薩希毛孢子菌，結果均為陰性(基線下方的曲線)；圖5示所述新生隱球菌重復三個反應的特異性擴增曲線；圖6示所述格特隱球菌重復三個反應的特異性擴增曲線；圖7示所述退火溫度60℃時，新生隱球菌的擴增曲線(Ct:25.32)；圖8示所述退火溫度60℃時，格特隱球菌的擴增曲線(Ct:24.51)；圖9示所述退火溫度62℃時，新生隱球菌的擴增曲線(Ct:24.63)；圖10示所述退火溫度62℃時，格特隱球菌的擴增曲線(Ct:24.56)；圖11示所述退火溫度58℃時，新生隱球菌的擴增曲線(Ct:25)；圖12示所述退火溫度58℃時，格特隱球菌的擴增曲線(Ct:23.83)。具體實施方式為了使本
的人員更好地理解本專利技術方案，下面通過具體實施方式對本專利技術提供的新生隱球菌和格特隱球菌快速檢測的引物、探針和方法做進一步說明。實施例1：新生隱球菌與格特隱球菌檢測與鑒定的靶基因、引物、探針及其試劑盒步驟1：靶基因位置的選擇本專利技術的專利技術人通過比對新生隱球菌和格特隱球菌不同基因型之間及其與其他真菌基因的序列差異，選擇銅鋅超氧化物歧化酶部位的序列片段作為靶基因位置，該基因片段為隱球菌所特有，并在新生隱球菌和格特隱球菌間存在差異。得到的一種檢測新生隱球菌和格特隱球菌靶基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1和/或SEQIDNo.2所示，其中SEQIDNo.1對應于新生隱球菌，SEQIDNo.2對應于格特隱球菌。步驟2：引物和探針的設計針對選擇的靶基因位置，采用primer設計軟件，進行引物設計。通過反復對比分析及前期的預實驗。最終獲得以下兩對引物和兩條探針。用于檢測新生隱球菌的引物和探針，具體序列如下：上游引物CN2F：SEQIDNo.3；下游引物CN2R：SEQIDNo.4；探針CN2P：SEQIDNo.5；其中探針序列的5’端標記本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測隱球菌的特定靶基因，其特征在于，靶基因序列如SEQ?ID?No.1和/或SEQ?ID?No.2所示，其中SEQ?ID?No.1對應于新生隱球菌，SEQ?ID?No.2對應于格特隱球菌。

【技術特征摘要】
1.一種檢測隱球菌的特定靶基因，其特征在于，靶基因序列如SEQIDNo.1和/或SEQIDNo.2所示，其中SEQIDNo.1對應于新生隱球菌，SEQIDNo.2對應于格特隱球菌。2.權利要求1所述的特定靶基因在制備隱球菌檢測試劑中的應用。3.用于檢測新生隱球菌的引物和探針，其特征在于，以SEQIDNo.1所示核苷酸序列為模板設計，以SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示核苷酸序列為引物，以SEQIDNo.5所示核苷酸序列為探針，具體序列如下：上游引物CN2F(5’-cttactcggcacaactccac-3’)：SEQIDNo.3；下游引物CN2R(5’cggtgaatcaaatgacgtacctc-3’)：SEQIDNo.4；探針CN2P(HEX-ccaccgatcacacatccacgtgctc-BHQ1)：SEQIDNo.5；其中探針序列的5’端標記熒光報告基團，3’端標記淬滅基團。4.用于檢測新生隱球菌的試劑盒，其特征在于，包括權利要求3所述的用于檢測新生隱球菌的引物和探針。5.根據權利要求4所述的用于檢測新生隱球菌的試劑盒，其特征在于，還包括緩沖液、MgCl2、dNTPs、TaqDN...

【專利技術屬性】
技術研發人員：沈定霞，郭玲，宋陽，
申請(專利權)人：中國人民解放軍總醫院，
類型：發明
國別省市：北京,11