一種制備基于蛋白A突變體的結合蛋白的方法技術

本發明專利技術涉及一種制備基于蛋白A突變體的結合蛋白的方法。此外，本發明專利技術提供編碼所述異源多聚體蛋白A突變體的核苷酸文庫和對應的蛋白質文庫，揭示了從所述突變體文庫中篩選對預定靶分子具有結合能力的蛋白A突變體的方法，分離編碼所述蛋白A突變體的核苷酸的方法，鑒定和分析所述蛋白A突變體的方法，以及生產所述蛋白A突變體的方法。本發明專利技術的方法具有產生更高結合能力的特異性結合蛋白的優點。

Method for preparing binding protein based on protein A mutant

The present invention relates to a method for preparing binding proteins based on protein A mutants. In addition, the invention provides a library of protein nucleotide library encoding the heterologous multimers of A mutants and corresponding to the predetermined target for screening has revealed the molecular method of binding protein A mutant ability from the mutant library, the method of separation encoding protein A mutant nucleotide, identification and analysis method the A mutant protein, and method of production of the mutant protein A. The method of the present invention has the advantages of producing a specific binding protein with a higher binding capacity.

【技術實現步驟摘要】
一種制備基于蛋白A突變體的結合蛋白的方法
本專利技術涉及制備具有新的特異性結合能力的異源多聚體蛋白A突變體的方法。本專利技術提供編碼所述異源多聚體蛋白A突變體的核苷酸文庫和對應的蛋白質文庫，揭示了從所述突變體文庫中篩選對預定靶分子具有結合能力的蛋白A突變體的方法，分離編碼所述蛋白A突變體的核苷酸的方法，鑒定和分析所述蛋白A突變體的方法，以及生產所述蛋白A突變體的方法。此外，本專利技術進一步提供能以高親和力特異性結合到預定靶分子上的、以異源多聚體蛋白A為基礎的新的結合蛋白質。
技術介紹
抗體能夠特異性識別和結合各類外源性物質，如小分子化合物、花粉、病毒、細菌等半抗原和抗原。在抗體分子Y型的兩個分叉頂端，各有一個由六條環狀多肽構成的互補區域(CDR)形成鎖狀結構，這些部位的氨基酸通過氫鍵、范德華力、電荷作用和疏水作用，與抗原表面的表位形成非共價鍵相互作用。在抗體基因中，編碼抗原結合部位的DNA可以隨機組合和突變，這一高變區的氨基酸可以發生非常豐富的變化，每一種特定的變化，可以賦予抗體具有和某一預定抗原相結合的能力。隨著基因重組技術、蛋白質工程和重組抗體庫體外親和篩選技術以及結構生物學的發展，越來越多的抗體三維晶體結構得到解析，抗體結合抗原的分子機理得到更好理解。抗體的局限性，比如分子量大、結構復雜等，促使研究者將來源于抗體CDR區域的“結合區域”這一概念，移植到一些非常穩定的非抗體類的蛋白(如本專利技術用到的異源多聚體蛋白A)表面。將這些蛋白表面的某些鄰近的氨基酸高度突變，可以人為的塑造出適當的結合區域，從而賦予這些蛋白與各類預定靶分子結合的能力。WO95/19374描述了以蛋白A的一個結構域單體為基礎的結合蛋白(Affibody)的產生。蛋白A是來源于金黃色葡萄球菌細胞表面的一種蛋白質，由5個高度同源的結構域組成，其結合許多哺乳動物物種(包括人)的免疫球蛋白。由于蛋白A單個結構域的分子量非常小(約6kDa)，其表面能提供的結合區域的面積相對較小，限制了其結合能力。根據已有技術信息，WO95/19374中產生的結合蛋白的親和力KD范圍通常在10-6-10-8M范圍，多數情況下在10-7M，例如初篩得到的結合EGFR的結合蛋白的親和力在130nM-185nM，結合H-Ras的結合蛋白的親和力在79nM-283nM，結合rVIII的結合蛋白的親和力在100nM-200nM。在此外，蛋白A單個結構域的結合區域由兩個并列的α螺旋一側的氨基酸構成，形成了一個扁平的結合面，這也限制了其能結合的靶分子表位的類型。
技術實現思路
本專利技術的目標是提供具有更高結合能力的、能夠普遍的識別更多不同類型的靶分子表位的多聚體蛋白A突變體的方法。本專利技術的進一步目標是提供以新穎的異源多聚體蛋白A為基礎，通過初始篩選，即可普遍制備高親和力結合蛋白的方法。更具體地，本專利技術提供了一種制備具有新的特異性結合能力的異源多聚體蛋白A突變體的方法，包括下列主要步驟：提供單體經過修飾的蛋白A的異源多聚體突變體的庫，所述庫包括異源多聚體蛋白質，所述異源多聚體蛋白質包括兩個或更多以首尾排列的方式連接在一起的蛋白A單體，其中所述異源多聚體蛋白質的至少兩個所述單體是通過對位于SEQIDNo：1中的9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32、35處的至少五個氨基酸的替換而進行的修飾，所述修飾的單體蛋白質與未修飾的蛋白A具有至少80％的氨基酸序列一致性；為所述經過修飾的蛋白A的庫提供潛在的靶分子；使所述修飾的蛋白質的庫與所述靶分子接觸；通過篩選方法得到異源多聚體蛋白A突變體。用于該申請中重要的術語的定義術語“蛋白A單體”是指蛋白A的一個結構域蛋白，包括與SEQIDNO:1完全一致的，或者氨基酸序列一致性超過80％的蛋白質。本說明書中，術語“異源多聚體蛋白”是包含兩個或更多不同修飾的蛋白A單體的蛋白質。因此，本專利技術的“異源多聚體”具有兩個獨立的結合區域的至少兩個不同修飾的蛋白A單體的融合蛋白，優選為異源二聚體或異源三聚體。根據本專利技術，由至少兩個不同的蛋白A修飾蛋白所組成的異源多聚體結合蛋白能結合預定抗原。其中的蛋白A修飾蛋白可以通過多種方式組合在一起，形成“頭尾相接”的融合蛋白，例如基因融合等。這種融合可以使多個不同的蛋白A修飾蛋白上的結合區域能夠組合起來，形成一個大的、整體性的結合區域。這種融合，類似于抗體可變區的多個CDR區域組合起來，共同形成了抗體結合部位。對應的，多個不同的蛋白A修飾蛋白上的結合區域，能夠分別結合到同一特定抗原的不同部位，這些部位組合起來，共同形成了抗原表位。術語“頭尾相接的融合”描述了把多個不同的蛋白A修飾蛋白連接起來形成融合蛋白的形式。把多個不同的蛋白A修飾蛋白按照(氨基端-羧基端)—(氨基端-羧基端)n的連接方向，連接起來形成異源多聚體融合蛋白，這里n取決于需要連接起來的蛋白A修飾蛋白的數量。在這種頭尾相接的連接形式中，相鄰的兩個蛋白A修飾蛋白可以直接連接在一起，也可以通過柔性連接多肽，比如，氨基酸序列為SGGGG的連接多肽，或者其他連接多肽，比如KPEVIDASELTPAVT，GGGGS等。其他通常用于基因融合的連接多肽也可以在這里使用。總之，異源多聚體可以通過把兩個或多個不同的蛋白A修飾蛋白，通過首尾相接的方式連接在一起，形成一個由兩個及兩個以上的蛋白A修飾蛋白組成的融合蛋白。通過柔性多肽將兩個或多個蛋白A修飾單體上的結合區域連接起來，所述的兩個或多個結合區域具有了更多的構象，提供了識別更多類型的靶分子表位的可能性。術語“群”或者“庫”、“文庫”特指由經過不同修飾的蛋白A的異源多聚體突變體混合而得到的集合。編碼所述經過修飾的蛋白A的異源多聚體突變體的DNA的混合也被成為核苷酸群。術語“群”或者“庫”、“文庫”都是同義的且能互換使用。本專利技術所述的“特異結合區”表示：形成聚合物的各蛋白A單體之間，突變位點由于電荷、空間結構和側鏈的疏水性/親水性等原因，突變的氨基酸與周圍的環境相互作用，形成一個連續的表面暴露區域，該連續區域能夠和預定靶分子特異性結合，該環境可以是溶劑，一般是水，或者其它分子。在本專利技術中，“氨基酸修飾”是指氨基酸替換、插入、缺失或者化學修飾；優選氨基酸替換。在具體的實施方式中，氨基酸修飾通過對蛋白A單體的第9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32、35處的至少五個氨基酸的替換來實現。術語“修飾”或“突變”指使用20種氨基酸的其他任一氨基酸對所選定位置的氨基酸進行替換。這兩者都是同義的且能互換使用。上述通過突變產生的蛋白A修飾蛋白所組成的異源多聚體蛋白文庫，可以通過噬菌體展示、核糖體展示、mRNA展示或細胞表面展示、酵母展示或細菌表面展示方法，進而通過體外定向篩選的方式，針對任一預定的靶分子進行篩選，使能特異性結合靶分子的異源多聚蛋白A突變體富集，從而得到此類結合蛋白。根據本專利技術，可以通過以下一種或多種方法，確定所述的蛋白A突變體與特定靶分子是否具有可定量的結合能力，比如酶聯免疫吸附實驗(ELISA)、等離子表面共振(SPR)、免疫熒光光譜(IF)、流式細胞術(FACS)、等溫滴定量熱法(ITC)和分析離心等。在本專利技術所采用的噬菌體展示方法中，重組蛋白A突變體展示在M13絲狀噬本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種制備基于蛋白A突變體的結合蛋白的方法，包括下列步驟：a)提供單體經過修飾的蛋白A的異源多聚體突變體的庫，所述庫包括異源多聚體蛋白質，所述異源多聚體蛋白質包括兩個或更多以首尾排列的方式連接在一起的蛋白A單體，其中所述異源多聚體蛋白質的至少兩個所述單體是通過對位于SEQ?ID?No：1中的9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32、35處的至少五個氨基酸的替換而進行的修飾，所述修飾的單體蛋白質與未修飾的蛋白A具有至少80％的氨基酸序列一致性；b)為所述經過修飾的蛋白A的庫提供潛在的靶分子；c)使所述修飾的蛋白質的庫與所述靶分子接觸；d)通過篩選方法得到異源多聚體蛋白A突變體，所述突變體以K

【技術特征摘要】
1.一種制備基于蛋白A突變體的結合蛋白的方法，包括下列步驟：a)提供單體經過修飾的蛋白A的異源多聚體突變體的庫，所述庫包括異源多聚體蛋白質，所述異源多聚體蛋白質包括兩個或更多以首尾排列的方式連接在一起的蛋白A單體，其中所述異源多聚體蛋白質的至少兩個所述單體是通過對位于SEQIDNo：1中的9、10、11、13、14、17、18、24、25、27、28、32、35處的至少五個氨基酸的替換而進行的修飾，所述修飾的單體蛋白質與未修飾的蛋白A具有至少80％的氨基酸序列一致性；b)為所述經過修飾的蛋白A的庫提供潛在的靶分子；c)使所述修飾的蛋白質的庫與所述靶分子接觸；d)通過篩選方法得到異源多聚體蛋白A突變體，所述突變體以KD范圍是10-7-10-12M的親和力結...

【專利技術屬性】
技術研發人員：宋波，
申請(專利權)人：武漢海沙百得生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：湖北,42