一種提高CRIPSR/Cas9靶向敲除基因產(chǎn)生非同源性末端接合效率的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)屬于分子生物學與生物醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種提高CRIPSR/Cas9靶向敲除基因NHEJ效率的方法。具體來說，本發(fā)明專利技術(shù)設計篩選出高效干擾pten基因表達的小分子干擾RNA，使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向敲除基因時，共轉(zhuǎn)染該小分子RNA，可以有效的提高靶基因的NHEJ效率。在細胞多個靶點驗證，均有明顯提高，該方法成本低、操作簡單、效率高，對于CRISPR/Cas9技術(shù)的效率和應用具有很好的促進作用。

A method for improving the efficiency of non homologous end joining in CRIPSR/Cas9 targeted knockout genes

The invention belongs to the technical field of molecular biology and biomedicine, and relates to a method for improving the efficiency of CRIPSR/Cas9 targeted knockout gene NHEJ. Specifically, the present invention selected efficient knockdown of PTEN gene expression by small interfering RNA, using the CRISPR/Cas9 system targeted knockout gene, transfection of the small molecule RNA, can effectively improve the efficiency of target gene NHEJ. The method has the advantages of low cost, simple operation and high efficiency, and has a good promoting effect on the efficiency and application of CRISPR/Cas9 technology.

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種提高CRIPSR/Cas9靶向敲除基因產(chǎn)生非同源性末端接合效率的方法
本專利技術(shù)屬于分子生物學與生物醫(yī)學
，具體涉及一種提高CRIPSR/Cas9靶向敲除基因非同源性末端接合(Non-homologousendjoining，簡稱NHEJ)效率的方法。
技術(shù)介紹
CRISPR/Cas系統(tǒng)是從細菌和古生菌對抗外來病毒或質(zhì)粒的適應性免疫系統(tǒng)發(fā)展而來，包括三種不同的類型，其中TypeⅡ型的CRISPR/Cas系統(tǒng)的DNA內(nèi)切酶Cas9只有一個亞基，結(jié)構(gòu)最為簡單，所以應用也最廣泛。除了Cas9蛋白外，該系統(tǒng)還包括兩條短的CRISPRRNAs（crRNAs）和trans-activatingcrRNAs（tracrRNA）。成熟的crRNA-tracrRNA復合體可以通過堿基互補配對指導Cas9蛋白到靶序列上，并在PAM（protospaceradjacentmotif）附近特異性剪切DNA雙鏈，形成DSB（doublestrandbreak）。DSB可以通過兩種途徑被修復，一種是非同源性末端接合（Non-HomologousEndJoiningNHEJ）DNA修復方式，另一種是同源重組修復（HomologyDirectedRepairHDR)方式。NHEJ修復方式可能產(chǎn)生堿基的插入或缺失，從而產(chǎn)生移碼突變，或者也可能突變成終止密碼子，這些突變形式都可以改變目的基因的開放閱讀框；HDR方式需要一段與被剪切片段同源的模板片段來修復DSB，這種修復方式可以將被用來作為模板的同源片段的序列復制到目的基因中，所以可以利用這種修復方式將特定的基因片段引入到目的基因中。Cas9有時較差的切割效率可能與DNA是如何修復的相關(guān)聯(lián)，這是因為DNA修復機制---基本的管家酶修復DNA中的任何可能導致致命性突變的斷裂或缺失---在不同細胞之間存在差異。他推斷與人基因組不存在同源性的寡核苷酸可能干擾這種修復過程，從而提高基因敲除成功率。CRISPR-Cas9基因編輯可以認為是切割和DNA修復之間的競爭：一旦Cas9進行切割，細胞精確地替換受到切割的DNA，隨后Cas9再次切割這種受到替換的DNA，從而陷入一種無盡的切割和修復的循環(huán)，直到這些修復酶發(fā)生錯誤，這些基因最終都失去功能。這些寡核苷酸可能會降低這種修復過程的保真度，或者說讓細胞切換到一種更加容易發(fā)生的修復過程，從而允許Cas9更容易讓基因發(fā)生斷裂。本專利技術(shù)可以極大的提高了CRISPR/Cas9敲除效率，同時使該技術(shù)更加的簡單、易操作。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)屬于分子生物學與生物醫(yī)學
，本專利技術(shù)涉及一種提高CRIPSR/Cas9靶向敲除基因NHEJ效率的方法。具體來說，本專利技術(shù)設計篩選出高效干擾pten基因表達的小分子干擾RNA，使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向敲除基因時，共轉(zhuǎn)染該小分子RNA，可以有效的提高靶基因的NHEJ效率。在細胞多個靶點驗證，均有明顯提高，該方法成本低、操作簡單、效率高。對于CRISPR/Cas9技術(shù)的效率和應用具有很好的促進作用。本專利技術(shù)技術(shù)方案如下：1、高效干擾人pten基因表達的小分子干擾RNA，設計、合成以及篩選；2、設計、構(gòu)建敲除人pten基因的CRIPSR/Cas9載體，并共轉(zhuǎn)染篩選得到的小分子干擾RNA，通過檢測靶位點產(chǎn)生的NHEJ效率，確認CRISPR/Cas9載體共轉(zhuǎn)染小分子干擾RNA是否可以提高NHEJ效率；3、將小分子干擾RNA應用于多個CRISPR/Cas9靶位點編輯驗證，確認小分子干擾RNA提高NHEJ效率的準確性。附圖說明為了使本專利技術(shù)的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本專利技術(shù)提供如下附圖：圖1為反轉(zhuǎn)錄PCR檢測pten基因的表達量（其中M為DL2000，1為pten-RNAi-1，2為pten-RNAi-1，3為pten-RNAi-3，4為pten-RNAi-4，5為pten-RNAi-5，PCR擴增264bp大小片段）；圖2為Lin28a兩個靶點區(qū)域PCR產(chǎn)物T7EndonucleaseI酶切產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（其中A組為小干擾RNA+PX458-Lin28A-T1，B組為小干擾RNA+PX458-Lin28A-T5，C組為PX458-Lin28A-T1，D組為PX458-Lin28A-T5，E組為小干擾RNA，F(xiàn)組為PBS）。具體實施方式下面將結(jié)合附圖，對本專利技術(shù)的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南（第三版，J.薩姆布魯克等著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)基因PTEN的CDS區(qū)域，并結(jié)合NCBIPrimer-BLAST設計引物序列，同時根據(jù)專利（201611252179.5）合成lin28a基因靶位點區(qū)域擴增引物，序列如下：通過在線軟件設計出5條針對PTEN基因的小干擾RNA序列，并合成，其對應的RNA序列如SEQIDNO.1--SEQIDNO.5所示。實驗具體步驟轉(zhuǎn)染前3天，復蘇人胚胎腎細胞（293T細胞株，中科院上海細胞庫），將細胞放入加有10%的FBS+DMEM培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前1天，傳代培養(yǎng)復蘇細胞；將培養(yǎng)293T細胞T75瓶中的培養(yǎng)基吸凈，加入2mL4℃冰箱取出的0.25%胰酶，使其均勻覆蓋瓶底，置于37℃培養(yǎng)箱中3~5min，取出，搖晃可發(fā)現(xiàn)細胞于底部脫離，將其全部晃下，加入3mL37℃水浴中預熱的10％FBS+DMEM培養(yǎng)基，用10mL移液管進行吹打，將細胞懸浮液收集、離心；轉(zhuǎn)染前1天，接種2×104個293T細胞至48孔培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)，使轉(zhuǎn)染時的細胞密度達到80％；實驗分組為pten-RNAi-1轉(zhuǎn)染組，pten-RNAi-2轉(zhuǎn)染組，pten-RNAi-3轉(zhuǎn)染組，pten-RNAi-4轉(zhuǎn)染組，pten-RNAi-5轉(zhuǎn)染組，PBS轉(zhuǎn)染組（對照組）每組6個復孔；小干擾RNA與轉(zhuǎn)染試劑：每孔加入小干擾RNA20pmol：轉(zhuǎn)染試劑1.0μL：用50μLOpti-MEM稀釋，輕輕吹吸3~5次混勻，室溫下靜置20min，隨后加入培養(yǎng)皿中進行細胞轉(zhuǎn)染（詳細步驟參見Lipofectamine2000使用說明書），轉(zhuǎn)染操作完成后，經(jīng)過37℃培養(yǎng)4h后，用10%FBS+DMEM培養(yǎng)基的完全培養(yǎng)基換液，繼續(xù)培養(yǎng)；1.將細胞培養(yǎng)至24h，使用PBS清洗一次細胞，加BeyozolReagent裂解細胞，室溫放置5min；2.每管加入0.2mL氯仿，劇烈震蕩離心管15s，室溫放置3min，離心12000g，4℃15min。3.離心后取上清，加入等體積的異丙醇，冰浴10min，離心12000g，4℃10min；4.離心后移去上清，用1mL75%的乙醇洗滌，然后離心7400g，4℃5分鐘；5.移去乙醇溶液，自然晾干5分鐘，再加入DEPC水溶解RNA；6.檢測RNA質(zhì)量；7.將提好的TotalRNA作為模板，用TakaraPrimeScriptII1ststrandcDNASynthesisKit貨號6210A/B合成cDNA；逆轉(zhuǎn)錄操作步驟：（1）準備混合體系如下：（2）65℃孵育5min；立刻放置冰上冷卻；（3）準備反應體系如下：（4）輕輕混勻；（5）在42℃孵育60min；（6）本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
本專利技術(shù)涉及一種可以有效提高CRISPR/Cas9技術(shù)在敲除基因應用的方法，其特征在于：轉(zhuǎn)染CRISPR/Cas9載體的同時，共轉(zhuǎn)染本專利技術(shù)中涉及的小分子干擾RNA，可以有效提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶位點形成的NHEJ的效率，具體包括如下步驟：（1）設計pten基因的gRNA，每個基因3個靶位點，合成對應的oligo和用BbsI酶切過的PX458?載體進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，涂布于帶有氨芐青霉素抗性的LB平板上，篩選陽性菌落，提取陽性菌落質(zhì)粒進行分析及測序，確認gRNA表達載體構(gòu)建正確；（2）將步驟（1）構(gòu)建的gRNA載體與小干擾RNA共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染293T細胞，另取構(gòu)建的gRNA載體轉(zhuǎn)染293T細胞（作為對照組）；（3）將步驟（2）轉(zhuǎn)染24~48小時，細胞經(jīng)流式分選，篩選出GFP標記的轉(zhuǎn)染陽性細胞；（4）提取基因組，PCR擴增靶位點區(qū)域片段，將PCR產(chǎn)物退火，并用T7E1酶切，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測，并進行灰度分析（indel）檢測NHEJ效率，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染小干擾RNA可以有效提高CRISPR/Cas9在靶位點形成NHEJ效率為3.39~7.8倍。

【技術(shù)特征摘要】
1.本發(fā)明涉及一種可以有效提高CRISPR/Cas9技術(shù)在敲除基因應用的方法，其特征在于：轉(zhuǎn)染CRISPR/Cas9載體的同時，共轉(zhuǎn)染本發(fā)明中涉及的小分子干擾RNA，可以有效提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶位點形成的NHEJ的效率，具體包括如下步驟：（1）設計pten基因的gRNA，每個基因3個靶位點，合成對應的oligo和用BbsI酶切過的PX458載體進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中，涂布于帶有氨芐青霉素抗性的LB平板上，篩選陽性菌落，提取陽性菌落質(zhì)粒進行分析及測序，確認gRNA表達載體構(gòu)建正確；（2）將步驟（1）構(gòu)建的gRNA載體與小干擾RNA共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染293T細胞，另取構(gòu)建的gRNA載體轉(zhuǎn)染293T細胞（作為對照組）；（3）將步驟（2）轉(zhuǎn)染24~48小時，細胞經(jīng)流式分選，篩選出GFP標記的轉(zhuǎn)染陽性細胞；（4）提取基因組，PCR擴增靶...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：周勇，申友鋒，
申請(專利權(quán))人：重慶高圣生物醫(yī)藥有限責任公司，
類型：發(fā)明
國別省市：重慶,50