IGFBP6基因突變體及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及IGFBP6基因突變體及其應(yīng)用。該突變導(dǎo)致椎間盤退變。本發(fā)明專利技術(shù)提供了IGFBP6基因突變體、突變蛋白、擴(kuò)增引物、探針及試劑盒。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
IGFBP6基因突變體及其應(yīng)用
本專利技術(shù)屬于分子病理學(xué)領(lǐng)域，特別涉及椎間盤退變相關(guān)的基因突變。
技術(shù)介紹
椎間盤退變是眾多脊柱退行性變的基礎(chǔ)，可引起椎間盤突出、椎間隙狹窄、脊柱節(jié)段不穩(wěn)、骨贅形成等多種繼發(fā)病變。臨床多引起腰痛和下肢放射痛，是骨科常見的一種疾病。尸檢研究表明椎間盤退變的發(fā)生率極高，83％-95％的成人存在椎間盤退變。因?yàn)槠涓甙l(fā)病率并且臨床癥狀明顯，嚴(yán)重影響患者日常工作和生活質(zhì)量，是目前骨科研究的重點(diǎn)之一。正常椎間盤位于相鄰椎體之間，由軟骨終板，纖維環(huán)和髓核組成。軟骨終板由纖維軟骨組成，在椎體上下各一個，平均厚度1mm，可以承受壓力，防止椎骨遭受超負(fù)荷壓力，保護(hù)椎體。椎間盤退變是個復(fù)雜的過程，目前尚不完全清楚，傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為椎間盤退變的病因首先考慮為年齡，性別，職業(yè)，吸煙史和車輛振動暴露史等支配因素。然而近年來的一些研究顯示基因有可能在椎間盤突出退變中起作用。特別是對同卵雙胞胎腰椎間盤突出癥患者的研究發(fā)現(xiàn)遺傳因素在椎間盤退變的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。臨床調(diào)查中也發(fā)現(xiàn)椎間盤突出患者直系親屬發(fā)生椎間盤突出的發(fā)病率明顯高于普通人群。目前與椎間盤退變相關(guān)的基因研究很多，然而所研究的基因均是與椎間盤退變相關(guān)的基因，而不是必然導(dǎo)致椎間盤退變的強(qiáng)效致病基因。全基因組外顯子測序技術(shù)尋找致病基因最早多應(yīng)用于單基因疾病致病基因的篩選。外顯子測序技術(shù)測序流程簡單，測序結(jié)果可靠，因此已經(jīng)成熟應(yīng)用于單基因疾病的致病基因篩選過程，并且取得了大量成果。然而人類密切相關(guān)的大部分的疾病如心血管疾病、椎間盤退變等，都是多基因作用或者基因與環(huán)境因素共同起作用的復(fù)雜疾病。近年來外顯子組測序技術(shù)也廣泛的應(yīng)用于尋找糖尿病、肥胖癥等復(fù)雜疾病的致病/易感基因，以及癌癥等。椎間盤退變的發(fā)病原因復(fù)雜，依靠簡單的篩選方法無法找出導(dǎo)致椎間盤退變的致病基因，因此需要尋找切實(shí)可行的基因篩選方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
專利技術(shù)人提出一種基于家系的強(qiáng)效基因篩選方法：假設(shè)在一個椎間盤退變疾病高發(fā)的家系，可能存在一個導(dǎo)致椎間盤退變的強(qiáng)效致病基因，如果排除環(huán)境因素的影響，那么在此家系中，此致病基因應(yīng)該存在于所有的患病個體，而不存在于所有的正常對照者。基于這一假設(shè)，專利技術(shù)人找到一個椎間盤退變疾病(腰椎間盤突出癥)高發(fā)的家系，通過外顯子測序技術(shù)找出其中幾名患者共同表達(dá)的基因突變，而將此基因突變在正常對照組中進(jìn)行驗(yàn)證，正常對照組中不表達(dá)此突變，那么此突變很可能是導(dǎo)致此家系椎間盤退變疾病高發(fā)的致病基因。專利技術(shù)人提出對于復(fù)雜疾病的研究應(yīng)用單基因病研究的方法，對一些保守性高、遺傳穩(wěn)定的家系進(jìn)行分析，可以找出其中的強(qiáng)效致病基因。本專利技術(shù)的一個目的是提供一種椎間盤退變的強(qiáng)效致病基因。本專利技術(shù)的另一目的是提供所述致病基因的檢測方法。本專利技術(shù)的另一目的是提供所述致病基因的應(yīng)用。在本專利技術(shù)的第一方面，提供了一種突變的IGFBP6蛋白，所述的突變的IGFBP6蛋白的氨基酸序列除144位外，其他部分與野生型IGFBP6蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO.：1)相同。在另一優(yōu)選例中，所述蛋白的氨基酸序列與SEQIDNO.：1相比，具有p.S144P突變，即所述蛋白的第144位氨基酸由絲氨酸(Ser)突變?yōu)楦彼?Pro)。在一優(yōu)選例中，所述突變蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.：2所示。在本專利技術(shù)的第二方面，提供了一種編碼本專利技術(shù)第一方面所述突變的IGFBP6蛋白的核苷酸序列。在一優(yōu)選例中，所述的核苷酸序列編碼IGFBP6基因突變體。在另一優(yōu)選例中，所述的核苷酸序列除第430位外，其他部分與編碼野生型IGFBP6蛋白的核苷酸序列(SEQIDNO.：3)相同。在另一優(yōu)選例中，所述核苷酸序列與SEQIDNO.：3相比，具有c.T430C突變，即所述核苷酸序列的第430位核苷酸由T突變?yōu)镃。在另一優(yōu)選例中，所述的核苷酸序列如SEQIDNO.：4所示。在另一優(yōu)選例中，本專利技術(shù)第一方面所述的突變的IGFBP6蛋白或本專利技術(shù)第二方面所述的核苷酸序列來源于人或非人哺乳動物，較佳地來源于人。在本專利技術(shù)的第三方面，提供了一種檢測易感椎間盤退變的生物樣品的系統(tǒng)，其特征在于，包括以下步驟：從所述生物樣品提取核酸樣本；確定所述核酸樣本的核苷酸序列；所述核酸樣本的核苷酸序列與SEQIDNO：3相比，具有c.T430C突變是所述生物樣品易感椎間盤退變的指征，任選地，所述生物樣品為選自人體血液、皮膚以及皮下組織的至少一種，任選地，所述核酸樣本為全基因組DNA。在本專利技術(shù)的第四方面，提供了第一方面所述的IGFBP6蛋白或第二方面所述核苷酸序列的用途，它們被用于檢測椎間盤退變或制備檢測椎間盤退變的試劑或試劑盒。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑包括：引物或引物對、探針、抗體、或核酸芯片；在另一優(yōu)選例中，所述引物對可以特異性擴(kuò)增出含第430位突變的C的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物，較佳地，擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為100-1000bp。在另一優(yōu)選例中，所述的探針可以特異性結(jié)合于含第430位突變的C的核酸片段。在另一優(yōu)選例中，所述的抗體可以特異性結(jié)合于含第144位突變的脯氨酸的多肽。在本專利技術(shù)的第五方面，提供了一種檢測椎間盤退變的試劑盒，所述的試劑盒包括：檢測IGFBP6基因第430位核苷酸位點(diǎn)的試劑，或檢測IGFBP6蛋白第144位氨基酸位點(diǎn)的試劑；在另一優(yōu)選例中，所述檢測IGFBP6基因第430位核苷酸位點(diǎn)的試劑選自下組：引物對、探針、核酸芯片。在另一優(yōu)選例中，所述檢測IGFBP6蛋白第144位氨基酸位點(diǎn)的試劑為抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的引物對為：核苷酸序列如SEQIDNO.：5和SEQIDNO.：6所示的引物組成的引物對。在本專利技術(shù)的第六方面，提供了一種檢測樣本中IGFBP6是否存在單核苷酸多態(tài)性(SNP)的方法，包括步驟：1)檢測待測樣本中IGFBP6基因或cDNA的核苷酸序列；2)將步驟1)的核苷酸序列與野生型IGFBP6基因的核苷酸序列進(jìn)行比較，如果對應(yīng)于野生型IGFBP6基因的第430位核苷酸不為T，則提示該樣本中的IGFBP6基因存在單核苷酸多態(tài)性。在另一優(yōu)選例中，所述的方法包括擴(kuò)增步驟，其中用于所述擴(kuò)增的引物對包括核苷酸序列如SEQIDNO.：5和SEQIDNO.：6所示的引物對。有益效果發(fā)掘椎間盤退變的強(qiáng)效致病基因，可以用于疾病的早期診斷、鑒別診斷及為開發(fā)疾病治療藥物提供科學(xué)依據(jù)。可以建立轉(zhuǎn)基因動物模型，為研究椎間盤退變發(fā)病機(jī)制提供有利條件，同時(shí)為修復(fù)退變椎間盤的各種治療提供良好的實(shí)驗(yàn)載體，對研究椎間盤退變的機(jī)制及其發(fā)展變化有重要意義，是實(shí)驗(yàn)室研究椎間盤退變機(jī)制和治療的前提。附圖說明下列附圖用于說明本專利技術(shù)的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本專利技術(shù)范圍。圖1：家系圖。黑色表示患有椎間盤退變的個體，灰色表示未患椎間盤退變的個體，帶有外框者為取樣對象。圖2：對突變型IGFBP6基因的sanger測序驗(yàn)證峰圖。箭頭為第430位，有兩個峰，基因型C/T，表示雜合突變。圖3：對野生型IGFBP6基因的sanger測序驗(yàn)證峰圖。箭頭為第430位，有一個峰，基因型T/T，表示未發(fā)生突變。具體實(shí)施方式本專利技術(shù)人經(jīng)過廣泛而深入的研究，經(jīng)過大規(guī)模篩選，首次發(fā)現(xiàn)一種椎間盤退變致病基因IGFBP6，及IGFBP6基因上的新突變。具體地，專利技術(shù)人以椎間盤退變患病家系為研究對象，對該本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種突變的IGFBP6蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列除144位外，其他部分與SEQ?ID?NO.：1相同，任選地，所述蛋白的氨基酸序列與SEQ?ID?NO.：1相比，具有p.S144P突變，任選地，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.：2所示。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種突變的IGFBP6蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列除144位外，其他部分與SEQIDNO.：1相同，任選地，所述蛋白的氨基酸序列與SEQIDNO.：1相比，具有p.S144P突變，任選地，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.：2所示。2.一種編碼權(quán)利要求1所述突變的IGFBP6蛋白的核苷酸序列。3.一種編碼IGFBP6基因突變體的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列除第430位外，其他部分與SEQIDNO.：3相同，任選地，所述核苷酸序列與SEQIDNO.：3相比，具有c.T430C突變，任選地，所述核苷酸序列如SEQIDNO.：4所示。4.與權(quán)利要求2或3所述的核苷酸序列互補(bǔ)的核酸探針。5.權(quán)利要求1所述蛋白或權(quán)利要求2或3所述核苷酸序列的用途，其特征在于，它們被用于檢測椎間盤退變或制備檢測椎間盤退變的試劑盒。6.一種篩選易感椎間盤退變的生物樣品的系統(tǒng)，其特征在于，包括：核酸提取裝置，用于從所述生物樣品提取核酸樣本，核酸序列確定裝置，與所述核酸提取裝置相連，用于對所述核酸樣本進(jìn)行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列，判斷裝置，與所述核酸序列確定裝置相連，以便基于所述核...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：戴蘭蘭，張銀剛，周翰林，孫甫，劉漢奎，張建國，屈繼寧，
申請(專利權(quán))人：深圳華大基因研究院，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東,44