海綿提取物的生物活性SRB測定方法技術

本發明專利技術涉及一種海綿提取物的生物活性SRB測定方法，步驟如下：(1)取對數期的腫瘤細胞，每孔200μL加入96孔板中，每孔加入不同濃度的樣品溶液2μL；(2)37oC培養17h；(3)離心吸去上清；(4)每孔加入50μL預冷的80%TCA溶液，移入4oC冰箱中固定1.5h，再用去離子水沖洗5次，室溫晾干；(5)每孔加入0.5%SRB染液50μL，室溫靜置30min后，用預冷的1%TCA水溶液沖洗4次，室溫晾干；(6)每孔加入150μL?Tris溶液溶解與蛋白結合的染料，用酶標儀在520nm下測定每孔吸光度OD值。按公式IR(%)=(OD

Bioactive SRB determination of sponge extracts

The invention relates to a method for the determination of biological activity, SRB sponge extract steps are as follows: (1) the logarithm period of tumor cells, each hole of 200 L with 96 well plates, each hole sample solution with different concentrations of 2 L; (2) 37 degrees C culture 17h; (3) to centrifugal suction the supernatant of each hole (4); adding 80%TCA solution 50 L pre cooled, 4 degree C 1.5h fixed into the refrigerator, and then rinse with deionized water 5 times and dried at room temperature; (5) per hole adding 0.5%SRB dye 50 L, room temperature for 30min after washing 4 times, the room temperature dry with 1%TCA solution pre cooling; (6) 150 L per hole adding Tris solution and protein binding dye, measured per hole absorbance od in 520nm using elisa. By formula IR (%) = (OD

【技術實現步驟摘要】
海綿提取物的生物活性SRB測定方法
本專利技術屬于海洋生物醫藥
，具體涉及一種海綿提取物的生物活性SRB測定方法。
技術介紹
海洋生物堿作為海洋生物的一種特征次級代謝產物，以其結構的新穎性、多樣性和顯著的生物活性成為海洋天然產物的重要研究對象。到目前為止，海洋來源的天然產物已經超過20000個，其中約三分之一的化合物含有氮原子，在46個海洋藥物中，33個屬于生物堿。海綿一直是海洋生物堿的主要來源，研究報道Calcarea綱中富含咪唑生物堿，在過去的30年中，共分離得到60多個咪唑生物堿。這類生物堿具有顯著的抗菌、抗炎和細胞毒活性。海綿是生物堿的主要來源，這些生物堿具有結構類型新穎，生物活性好的特征。Calcarea綱的海綿分布與全球各個海域，其中Leucetta和Clathrina屬海綿被報道其特征性化學成分為咪唑類生物堿，在過去30年中，從這兩個屬中分離到的咪唑類生物堿已超過60個。咪唑類生物堿的結構以2-氨基咪唑環為基本母核，2位氨基通常連有取代基乙內酰脲，N1，C-4，C-5位常連有苯環取代基，C-4，C-5位連有苯環的稱為naamines或naamidines，N1，C-4位連有苯環的結構類型稱作isonaamines或isonaamidines。
技術實現思路
本專利技術旨在為海綿的提取物提供一種方便可靠的生物活性測定方法。一種海綿提取物的生物活性SRB測定方法，步驟如下：(1)取對數期的腫瘤細胞，用新鮮的RPMI-1640培養基調整細胞懸液的濃度為2×105個/ml，每孔200μL加入96孔板中，每孔加入不同濃度的樣品溶液2μL；(2)37oC培養17h；(3)離心3min(4oC、3000prm)，吸去上清；(4)每孔加入50μL預冷的80%TCA溶液，移入4oC冰箱中固定1.5h，再用去離子水沖洗5次，室溫晾干；(5)每孔加入0.5%SRB染液(1%的TCA溶液)50μL，室溫靜置30min后，用預冷的1%TCA水溶液沖洗4次，去除未結合的染料，室溫晾干；(6)每孔加入150μL非緩沖Tris溶液溶解(10mM，pH=10.5)與蛋白結合的染料，用酶標儀在520nm下測定每孔吸光度OD值。在96孔板中每個樣品濃度設3孔，另設空白對照3孔，取3孔平均值，按公式IR(%)=(OD空白-OD樣品)/OD空白×100%計算細胞增殖抑制率(IR%)，再利用Bliss方法由各種濃度的IR求出半數抑制濃度(IC50)的標準差和平均值。本專利技術的測定原理：磺酰羅丹明B(SulforhodamineB，SRB)比色法，主要用來檢測細胞增殖情況。SRB是一種粉紅色陰離子染料，易溶于水，在酸性條件下可特異性地與細胞內組成蛋白質的堿性氨基酸結合；在520nm波長下產生吸收峰，吸光值與細胞量成線性正相關，故可用作細胞數的定量檢測。本專利技術的測定方法相對于現有技術簡單快速、而且檢測結果可靠，適于推廣應用。具體實施方式下面結合具體實施例對本專利技術做進一步詳細說明。選擇HeLa和A549腫瘤細胞株用SRB法對從海綿分離得到的咪唑生物堿類化合物(PH-1~PH-5)進行了體外抗腫瘤活性篩選，對初篩結果見表1-2，分析表中數據可以看出在濃度為50μM濃度水平，化合物PH-4對腫瘤細胞株HeLa、A549表現出強的抑制活性，抑制率在90%左右，化合物PH-5對兩種腫瘤細胞株均表現出強的抑制活性，抑制率都在90%以上，化合物(PH-1~PH-3)對兩種細胞株的抑制活性均較弱。表1化合物PH-1~PH-5對HeLa腫瘤細胞株的抑制率(%)表2化合物PH-1~PH-5對A-549腫瘤細胞株的抑制率(%)對初篩活性較好的化合物(抑制率大于30%)進行了IC50測試。IC50結果顯示化合物PH-4對HeLa和A549細胞株顯示出中等強度的抑制活性,IC50值分別為21.4和22.1uM。由此可以看出化合物PH-4，PH-5對腫瘤細胞株具有高度的選擇性，且對K562細胞株具有較強的細胞毒活性。本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種海綿提取物的生物活性SRB測定方法，其特征在于，步驟如下：(1)取對數期的腫瘤細胞，用新鮮的RPMI?1640培養基調整細胞懸液的濃度為2×10

【技術特征摘要】
1.一種海綿提取物的生物活性SRB測定方法，其特征在于，步驟如下：(1)取對數期的腫瘤細胞，用新鮮的RPMI-1640培養基調整細胞懸液的濃度為2×105個/ml，每孔200μL加入96孔板中，每孔加入不同濃度的樣品溶液2μL；(2)37oC培養17h；(3)離心3min(4oC、3000prm)，吸去上清；(4)每孔加入50μL預冷的80%TCA溶液，移入4oC冰箱中固定1.5h，再用去離子水沖洗5次，室溫晾干；(5)每孔加入0.5%SRB染液(1%的TCA溶液...

【專利技術屬性】
技術研發人員：褚方強，
申請(專利權)人：青島清泉生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：山東,37