一種利用5-磷酸吡哆醛制備固定金屬親合材料的方法技術

本發明專利技術公開了一種將螯合劑5?磷酸吡哆醛用于制備固定金屬親合材料的方法，及該固定金屬親合材料在樣品前處理中的應用。本發明專利技術首先選取幾種常用的納米材料Y進行化學修飾，制備氨基修飾的納米材料，得到Y?NH2；再將5?磷酸吡哆醛接到Y?NH2上，得到表面修飾磷酸根的Y?NH2?PLP；最后在磷酸根上固載金屬離子，得到Y?NH2?PLP?M

Using a 5 pyridoxal phosphate preparation method of immobilized metal affinity material

The invention discloses a preparation method of immobilized metal affinity material for chelating agent 5 pyridoxal phosphate, and the immobilized metal affinity material application in sample pretreatment. The invention first selects several commonly used Y nano materials by chemical modification, preparation of nano materials modified by amino, Y NH

【技術實現步驟摘要】
一種利用5-磷酸吡哆醛制備固定金屬親合材料的方法
本專利技術屬于分析化學
，具體涉及一種將5-磷酸吡哆醛用于制備固定金屬親合材料的方法，及其在樣品前處理中的應用。
技術介紹
蛋白質磷酸化是一種可逆的轉錄后修飾，在各種生理功能中都有重要的作用。目前，質譜技術由于其高靈敏度、高通量被廣泛用于磷酸化多肽的研究中。然而由于磷酸化蛋白在生物樣品里的含量低，并且磷酸化多肽在質譜中的離子化效率比非磷酸化多肽要低，使得我們難以對其進行直接分析。因此，在質譜分析前對樣品中的磷酸化多肽進行富集顯得十分重要。固定金屬親合色譜(Immobilizedmetalaffinitychromatography，IMAC)作為一種快速、簡單易用和經濟的純化技術，近年來被研究者廣泛應用于磷酸化肽的富集。其基本原理是將金屬離子固定于一定的配體上，然后利用金屬離子與磷酸根基團之間的配位作用來萃取磷酸化多肽。吸附到材料上的磷酸化多肽可以通過磷酸鹽或者堿性溶液解吸下來。其中，研究最多的配體為亞氨基二乙酸(IDA)、次氮基三乙酸(NTA)和磷酸根基團等，且磷酸根基團修飾的多孔硅膠比傳統的IMAC材料體現出更好的選擇性。因此，在接下來的幾年中，人們制備了一系列含磷酸根基團的材料，并將其用于復雜生物樣品中磷酸化多肽的分離和富集，然而，在制備含磷酸根基團的材料的過程中，經常需要用到一些毒性較大的試劑，并且合成過程較為復雜。
技術實現思路
為了克服現有技術中存在的不足，本專利技術引入一種新的配體—5-磷酸吡哆醛(Pyridoxal5′-phosphate,PLP)，它是維生素B6在體內的活性型代謝產物，且具有雙功能反應基團，分別是醛基和磷酸根。本專利技術提供的技術方案具體如下：一種固定金屬親合材料的制備方法，包括以下步驟：(1)將活化過的納米材料Y分散在乙醇中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷進行攪拌，得到氨基修飾的納米材料Y，即Y-NH2；所述的納米材料Y為納米SiO2、Fe3O4@SiO2納米微球或碳納米管；(2)向步驟(1)得到的Y-NH2中加入pH＝7.4的磷酸緩沖液，然后加入5-磷酸吡哆醛和NaBH3CN，室溫反應，Y-NH2表面被磷酸根修飾，將所得固體產物清洗后室溫干燥，得到Y-NH2-PLP；(3)向金屬鹽溶液中加入Y-NH2-PLP，室溫震蕩5-10h，所得固體產物依次用乙醇、水和丙酮清洗，60℃真空干燥，得到固定金屬親合材料，即Y-NH2-PLP-Mn+。所述步驟(1)中，納米SiO2或Fe3O4@SiO2納米微球的活化方式為：將納米SiO2或Fe3O4@SiO2納米微球分散在鹽酸中室溫靜置0.5h以上；碳納米管的活化方式為：將碳納米管分散在濃硫酸、濃硝酸體積比為3:2的混合液中50℃攪拌20h以上。所述步驟(1)中，納米SiO2或Fe3O4@SiO2納米微球與3-氨丙基三乙氧基硅烷一起進行攪拌的溫度為室溫；碳納米管與3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)一起進行攪拌的溫度為70℃。所述步驟(2)中，固體產物的洗滌方式為：依次用乙醇、二次水和丙酮清洗。步驟(2)中，所述的金屬鹽為硫酸鈦、氯化鎵、氯化鐵中的一種。一種固定金屬親合材料，由上述制備方法制備得到。上述固定金屬親合材料在樣品前處理中的應用。本專利技術的原理如下：本專利技術通過席夫堿反應在氨基化納米材料(Y)表面修飾磷酸根基團，得到Y-NH2-PLP；繼而在磷酸根基團上修飾金屬離子，得到Y-NH2-PLP-Mn+固定金屬親和色譜(Immobilizedmetalaffinitychromatography，IMAC)吸附劑，該吸附劑的螯合劑為5-磷酸吡哆醛。本專利技術通過改變納米材料Y，分別選擇二氧化硅(SiO2)，氧化碳納米管(OCNT)和包硅磁顆粒(Fe3O4@SiO2)制備了三種不同基地材料的Y-NH2-PLP(Y＝SiO2、OCNT或Fe3O4@SiO2)。本專利技術具有以下優點和有益效果：(1)本專利技術的修飾方法簡單、省時，且不會破壞基底材料的形貌特征，而且該修飾對基底材料進行功能化，增加了基底材料的實用性。(2)本專利技術制備的固定金屬親合材料Y-NH2-PLP-Mn+可作為IMAC吸附劑，利用金屬離子與磷酸根的親和作用，應用于生物樣品中磷酸化肽的選擇性富集，成功地應用于標準多肽混合液、牛奶酶解液、人類血清樣品、鼠腦裂解液中磷酸化多肽的萃取等領域。附圖說明圖1為Y-NH2-PLP-Mn+(以Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Ti4+為例)制備的流程圖。圖2為β-酪蛋白和牛血清蛋白(BSA)酶解混合液(1:500)的質譜圖；其中，圖2(a)表示直接分析；圖2(b)表示經過Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Ti4+萃取后；圖2(c)表示經過SiO2-NH2-PLP-Ti4+萃取后；圖2(d)表示經過CNT-NH2-PLP-Ti4+萃取后；磷酸化多肽用其m/z值標記。圖3為β-酪蛋白和牛血清蛋白(BSA)酶解混合液(1:500)的質譜圖；其中，圖3(a)表示經過Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Ga3+萃取后；圖3(b)表示經過Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Fe3+萃取后；磷酸化多肽用其m/z值標記。圖4為β-酪蛋白和BSA酶解混合液(1:1000)的質譜圖；其中，圖4(a)表示直接分析；圖4(b)表示經過Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Ti4+萃取后；磷酸化多肽用其m/z值標記。圖5為血清和脫脂牛奶酶解液的質譜圖；其中，圖5(a)表示直接分析的血清樣品；圖5(b)表示Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Ti4+萃取后的血清樣品；圖5(c)表示直接分析的脫脂牛奶酶解液樣品；圖5(d)表示Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Ti4+萃取后的脫脂牛奶酶解液樣品。圖6為鼠腦裂解液中磷酸化多肽的情況分析圖。具體實施方式下面結合附圖和實施例進一步闡述本專利技術，但這些實施例僅限于說明本專利技術，并不能限制本專利技術的范圍。實施例1首先制備氨基修飾的納米材料，得到Y-NH2；再將5-磷酸吡哆醛接到Y-NH2上，得到表面修飾磷酸根的Y-NH2-PLP；最后在磷酸根上固載金屬離子，得到Y-NH2-PLP-Mn+。1.氨基修飾的納米材料(Y-NH2)的制備，根據納米材料不同，其制備方法如下：①SiO2-NH2的制備：將0.5g納米SiO2分散在25mL1M的HCl水溶液中活化30min；經水及乙醇清洗后，將其分散在50mL乙醇中；在上述懸浮液中加入2mLAPTES，室溫下攪拌3h，得到氨基鍵合硅膠納米顆粒。②Fe3O4@SiO2-NH2的制備：將2.0gFeCl2·4H2O和5.4gFeCl3·6H2O溶解在2MHCl水溶液中，通入氮氣除去溶解氧，然后加入30mL濃氨水(25wt％)，攪拌30min，得到Fe3O4納米顆粒；將Fe3O4納米顆粒經反復磁分離及水洗后，分散于50mL水中待用。取5mLFe3O4納米顆粒懸浮液，用乙醇清洗后，分散于40mL乙醇中，并超聲1h；之后加入1.5mL濃氨水，6mL水以及1.5mLTEOS，并在40℃下攪拌2h。最后所得的Fe3O4@SiO2納米顆粒經去離子水及乙醇清洗后，置于60℃真空干燥箱中烘干待用。將0.5gFe3O4@SiO2分散在25mL1M的HCl水溶本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種固定金屬親合材料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)將納米材料Y分散在乙醇中，加入3?氨丙基三乙氧基硅烷進行攪拌，得到氨基修飾的納米材料Y，即Y?NH

【技術特征摘要】
1.一種固定金屬親合材料的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)將納米材料Y分散在乙醇中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷進行攪拌，得到氨基修飾的納米材料Y，即Y-NH2；所述的納米材料Y為納米SiO2、Fe3O4@SiO2納米微球或氧化碳納米管；(2)向步驟(1)得到的Y-NH2中加入pH＝7.4的磷酸緩沖液，然后加入5-磷酸吡哆醛和NaBH3CN，室溫反應，Y-NH2表面被磷酸根修飾，將所得固體產物清洗后室溫干燥，得到Y-NH2-PLP；(3)向金屬鹽溶液中加入Y-NH2-PLP，室溫震蕩5-10h，所得固體產物依次用乙醇、水和丙酮清洗，60℃真空干燥，得到固定金屬親合材料，即Y-NH2-PLP-Mn+。2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟(1)中所采用的納米SiO2或Fe3O4@SiO2納米微球在使用前分散在鹽酸中室溫活化0.5h以上。...

【專利技術屬性】
技術研發人員：馮鈺锜，王倩，
申請(專利權)人：武漢大學，
類型：發明
國別省市：湖北,42