基于納米結構的蛋白質單分子電子器件及其制備和應用制造技術

本發明專利技術公開了一種基于納米結構的蛋白質單分子電子器件及其制備和應用。將單個蛋白質或其復合物分子固定于納米孔處的對電極上，通過檢測溶液中該蛋白質或其復合物分子的電導率來表征其構象漲落的動力學特征，從而實現對蛋白質的活性及其與底物分子的生化反應過程的檢測。本發明專利技術可作為一種極具發展潛力的第三代測序方法，無需制備特殊的DNA測序文庫，無需對核酸進行標記，可進行超長、連續、快速、精準的堿基閱讀，若制備成高通量平行的分子器件，可實現超低成本的DNA測序等。

Protein single molecule electronic device based on nano structure and preparation and application thereof

The invention discloses a protein single molecule electronic device based on nano structure, and preparation and application thereof. A single protein or its complex molecules fixed on the nano hole on the electrode. The kinetic characteristics of the protein in solution by measuring the conductivity or the complex molecules to characterize the conformational fluctuation, so as to achieve the activity of the protein and substrate molecule biochemical reaction process detection. The third generation sequencing method of the invention can be used as a potential, without special preparation of DNA sequencing library, without labeling of nucleic acid, and can be long, continuous, rapid and precise reading base prepared, if the molecular device can realize high-throughput parallel sequencing, DNA ultra low cost etc..

【技術實現步驟摘要】
基于納米結構的蛋白質單分子電子器件及其制備和應用
本專利技術是涉及一種單酶生物傳感器，可以用于單分子DNA的測序,也可用于檢測溶液中濃度極低的底物分子,屬于第三代DNA測序器件。
技術介紹
DNA測序技術是近代生命科學發展的重要里程碑之一。近十年來，低成本、高通量DNA測序技術的出現，引起了生命這一高度復雜系統中最為龐大、最為核心的核酸序列信息爆發性地增長，使生命科學和醫學面臨前所未有的機遇和挑戰。生命遺傳密碼的徹底破譯將成為可能，遺傳信息大數據的普及將惠及到人類社會每一個普通成員的生存和健康。目前大量使用的新一代測序技術是所謂的第二代測序技術。該測序技術通過對被測核酸進行平行擴增，構建測序文庫，克隆出上百萬固相化單鏈核酸模板片段，進行高通量并行序列測定。第二代測序技術存在下列不足：(1)DNA測序文庫制備需要較大量的起始DNA樣本；(2)樣本的平行擴增可能導致測序文庫制備的偏性；(3)制備測序文庫需要大量的分子生物學操作，文庫制備時間較長，成本高；(4)通過DNA生物合成反應在DNA測序模板上進行逐個堿基閱讀，一次生化反應僅能閱讀一個堿基且讀長較短，這也是測序速度和通量難以提升的瓶頸；(5)測序結果報告周期長。因此雖然第二代測序技術比第一代桑格測序技術在測序通量方面具有巨大優勢，在不到十年時間內使人類個體基因組的測序成本下降了近萬倍，但是與未來應用于實際的需求相比，第二代測序技術仍然是一項昂貴的技術，不利于推廣應用。第三代測序技術是目前國際學術界和產業界追捧的對象。第三代測序技術有如下三個特點：(1)實現單分子DNA測序。無需對測序對象進行擴增，能夠克服由基因擴增引起的測序偏向性；(2)實現連續測序。也就是DNA鏈上堿基的閱讀是不間斷的，這一特性不僅能夠大幅度提高測序速度，也會使DNA的讀長大幅度增加；(3)更低的測序成本。第三代測序技術在生化反應中無需不斷加入生化試劑，測序沒有試劑成本。由上述三個特征可以看出，第三代測序技術的實現將會是生命科學和醫學發展史上的又一里程碑，幫助人們隨時隨地、實時、低成本地獲取人體、環境各種各樣的核酸信息，隨時掌控生命體中遺傳與變異、表達與調控、感染和防衛等事件，真正促進4P和精準醫療的實現。目前為止，第三代測序技術按原理可以分為三類。(1)成像測序法通過高分辨率成像技術進行核酸序列鑒定，是最早報導的單分子DNA測序技術。早在1977年Cole等通過鋨等配位化合物與堿基進行特異性結合，并從電子顯微鏡上觀察到Os點陣，獲得了單鏈DNA影像(Coleetal.Molecularmicroscopyoflabeledpolynucleotides:stabilityofosmiumatoms.JMolBiol(1977)vol.117,387-400)。近二十多年來，有許多用掃描探針顯微鏡對核酸分子進行顯微成像和堿基識別的報導，不過其識別的準確度和速度還遠遠達不到DNA測序的要求(Driscolletal.Atomic-scaleimagingofDNAusingscanningtunnelingmicroscopy.Nature(1990)vol.346,294-296；Tanakaetal.PartialsequencingofasingleDNAmoleculewithascanningtunnelingmicroscope(2009)vol.4,518-522)。(2)合成測序法本世紀初，美國加州理工發表了單分子合成測序的成果。在玻片上構建單分子DNA測序文庫，采用具有可切除封閉基團的熒光標記堿基進行測序(Harrisetal.Single-moleculeDNAsequencingofaviralgenome.Science(2008)vol.320,106–109.)，但是該方法測序通量低、讀長短、錯誤率高且產品成熟度差，并沒有形成銷售。PicBio等公司在核苷酸的磷酸分子上修飾熒光基團，通過檢測合成過程中能夠自動切除的熒光基團，實現單分子DNA堿基的連續閱讀(Eidetal.Real-TimeDNASequencingfromSinglePolymeraseMolecules.Science(2009)vol.323,133-138.)。為了提高單分子熒光檢測的靈敏度，其芯片采用Z波導腔。該技術能夠自動、快速、并行地實現單分子DNA測序，但測序成本高、通量低，準確性較差。(3)納米孔測序法納米孔測序方法使單鏈DNA分子在電場驅動下穿過納米尺度的微孔，通過實時檢測過孔電流的變化，識別過孔單鏈DNA上的堿基(Michael.OxfordNanoporeannouncementsetssequencingsectorabuzz.NatureBiotechnol.(2012)Vol.30,295–296.)。制備納米孔的材料可以采用天然的或經改造的蛋白質分子(如α溶血素(Clarketal.Continuousbaseidentificationforsingle-moleculenanoporeDNAsequencing.NatureNanotechnol.(2009)vol.4,265-270.)、Msp蛋白(Manraoetal.ReadingDNAatsingle-nucleotideresolutionwithamutantMspAnanoporeandF29DNApolymerase.NatureBiotechnol.(2012)vol.30,349–353；Cherfetal.AutomatedforwardandreverseratchetingofDNAinananoporeatprecision.NatureBiotechnol.(2012).vol.30,344–348.))，也可以使用微納加工制備的固態納米孔(如氮化硅(Iqbaletal.Solid-statenanoporechannelswithDNAselectivity.NatureNanotechnol.(2007)vol.2,243-248.)、石墨烯(Garajetal.Grapheneasasubnanometertrans-electrodemembrane.Nature(2010)vol.467,190-193.))。生物納米孔在單鏈DNA分子堿基的準確識別方面還存在技術瓶頸。固態納米孔由于孔徑的可控性和穩定性、單鏈過孔速度、納米孔長度等因素，尚未實現DNA鏈單個堿基的識別。一些公司通過在納米孔上構建場效應器件、引入可檢測橫向隧道電流的對電極、組裝具有分子識別功能的分子基團、增加熒光標記分子等方法，試圖提高單堿基識別能力。生命系統中存在著多種能夠高效精準識別核酸堿基序列的蛋白質分子。將蛋白質分子在識別堿基時其分子構象產生的微小變化轉換成電信號，并進行放大和快速測定，無疑是一種理想的測序方法。本專利技術就是針對目前單分子DNA測序存在的成本高、準確率低、重復性差等問題，通過檢測DNA聚合酶或RNA聚合酶等蛋白質分子在核酸合成過程中導電率的波動情況，推斷單鏈核酸上的堿基序列，發展一種低成本、快速核酸測序器件。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種蛋白質分子電子器件及其制備方法本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種蛋白質分子電子器件，包括懸空膜結構、納米對電極和蛋白質或其復合物分子，其中：懸空膜結構的膜上具有一納米孔，納米孔的直徑小于等于10納米；納米對電極包括兩個納米電極，分別設置在納米孔兩側，電極之間的間隙為1～100納米；單個蛋白質分子或蛋白質復合物分子組裝在納米孔處，連接兩個納米電極。

【技術特征摘要】
1.一種蛋白質分子電子器件，包括懸空膜結構、納米對電極和蛋白質或其復合物分子，其中：懸空膜結構的膜上具有一納米孔，納米孔的直徑小于等于10納米；納米對電極包括兩個納米電極，分別設置在納米孔兩側，電極之間的間隙為1～100納米；單個蛋白質分子或蛋白質復合物分子組裝在納米孔處，連接兩個納米電極。2.如權利要求1所述的蛋白質分子電子器件，其特征在于，所述懸空膜結構的懸空膜是硅、氮化硅、二氧化硅、云母或石墨烯薄膜材料。3.如權利要求1所述的蛋白質分子電子器件，其特征在于，所述納米電極的材料是金、鉑、鈀或它們的合金，或者是石墨烯。4.如權利要求1所述的蛋白質分子電子器件，其特征在于，所述蛋白質或其復合物分子根據不同的檢測目的進行選擇，所述蛋白質選自下列蛋白質中的一種：DNA聚合酶、RNA聚合酶、DNA外切酶、逆轉錄酶、脲酶；蛋白質復合物是所述蛋白質與其他生物分子組成的復合物。5.權利要求1～4任一所述蛋白質分子電子器件的制備方法，包括以下步驟：1)制備懸空膜結構；2)在懸空膜上制備納米對電極，組成納米對電極的兩個納米電極的尖端之間的距離在1～100納米，除尖端外，納米電極的其余部分覆蓋絕緣層；3)在懸空膜上、兩個納米電極之間加工出直徑小于等于10納米的納米孔；4)對納米電極進行化學修飾，然后使蛋白質或其復合物分子交聯...

【專利技術屬性】
技術研發人員：陸祖宏，李清寧，丁韜力，嚴勇，萬成，魏穎穎，孫利，李成強，孫杰，王磊，
申請(專利權)人：北京大學，北京普若博升生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：北京,11