本發明專利技術涉及一種利用熒光PCR技術高靈敏檢測低危型人乳頭瘤病毒（HPV）6,11型核酸的試劑盒。它公開了檢測用的特異性擴增引物和熒光探針、PCR反應緩沖液、對照品以及核酸提取試劑。本發明專利技術還提供了用于檢測HPV6,11型的試劑盒制備和使用方法。本發明專利技術適用于人尖銳濕疣泌尿生殖道分泌物樣本中HPV6,11型病毒的定性檢測，試劑盒操作簡便快速，方便儀器自動化操作，克服了現有技術檢測靈敏度低、容易造成漏檢誤診等問題。
A highly sensitive human papillomavirus type 6,11 nucleic acid detection kit
The present invention relates to a kit for detecting low risk human papilloma virus (HPV) type 6,11 nucleic acid with high sensitivity using fluorescent PCR technology. A specific amplification primer and a fluorescent probe, a PCR reaction buffer, a reference substance, and a nucleic acid extraction reagent are disclosed. The present invention also provides kits for the preparation and use of kits for detecting type HPV6,11. The invention is applicable to the qualitative detection of HPV6,11 virus condyloma in urogenital tract in the sample, the kit is simple and rapid, convenient automatic operation, overcomes the sensitivity of existing technology is low, easy to cause problems such as missing misdiagnosis.
【技術實現步驟摘要】
一種高靈敏人乳頭瘤病毒6,11型核酸檢測試劑盒
本專利技術涉及一種高靈敏度的人乳頭瘤病毒6,11型核酸檢測試劑盒，屬于生物
技術介紹
人乳頭瘤病毒（HumanPapillomavirus,HPV）屬于乳頭瘤病毒科，是一種小分子的、無被膜包被的、環狀雙鏈DNA病毒，基因組長約8000堿基對（bp），分為3個功能區，即早期轉錄區（E區）、晚期轉錄區（L區）和非轉錄區（長控制區，LCR）。HPV通過直接或間接接觸污染物品或性傳播感染人類。該病毒不但具有宿主特異性，而且具有組織特異性，只能感染人的皮膚和粘膜上皮細胞，引起人類皮膚的多種乳頭狀瘤或疣及生殖道上皮增生性損傷。HPV根據其基因組核苷酸序列不同，目前已經分離出130多種基因型，不同基因型別引起不同的臨床表現。對于感染生殖道和肛門的HPV，根據各基因型別致病力大小或致癌危險性大小可分為低危型和高危型兩大類。在有性生活史的女性中生殖道HPV感染具有普遍性，據統計70%～80%的女性在其一生中會有至少一次的HPV感染，但大多數感染為自限性，超過90％的感染的女性會出現一種有效的免疫應答，在沒有任何長期的健康干預時在6到24個月之間可以清除感染。低危型HPV一般與尖銳濕疣或低度鱗狀上皮內病變相關，極少引起浸潤癌，其中最常見的基因型是6和11型。尖銳濕疣是國家衛生部規定要求監測的八大性傳播疾病之一，它的發病率僅次于淋病，由于病情易反復發作，傳染性極強，已經成為嚴重危及人們正常生活的常見性病之一。目前研究表明在尖銳濕疣中有HPV6,11型引起的占90%以上，且兩種亞型復合感染情況最常見，曾仁山等報告了采用PCR方法對931例尖銳濕疣組織中的HPVDNA進行檢測及分型結果，在931例尖銳濕疣組織中有738例檢出HPVDNA陽性，檢出率為79.27％，其中HPV6、11型陽性檢出者538例，占75.79％。由于HPV病毒難于培養，目前臨床上檢測HPV6,11型的常用方法依賴于分子生物學核酸檢測方法，包括熒光PCR法（CN101676408A、CN101709335B）、膜雜交固相芯片法（蔣明軍等，中華皮膚科雜志，2005,38（5）：262-264）和液相懸浮芯片法（CN1814796A），特別是TaqMan探針熒光PCR法，以其快速、簡便、靈敏、特異的優點，在臨床機構廣泛使用。但值得注意的是，現有檢測技術方法或試劑盒中的樣本核酸提取方法以堿裂解煮沸法為主，核酸提取物中含有較多的PCR抑制物，容易造成檢測結果“假陰性”；同時，試劑盒的HPV6,11型DNA檢測靈敏度多在103copy/ml，對低濃度樣本容易造成漏檢，造成臨床誤診和治療延誤。
技術實現思路
本專利技術提供一種高靈敏的人乳頭瘤病毒（HPV）6,11型核酸檢測試劑盒，其特征在于，試劑盒包含核酸擴增試劑、對照品以及核酸提取試劑，擴增試劑所用的一對熒光PCR檢測引物序列為SEQIDNo:1和SEQIDNo:2，熒光探針序列分別為SEQIDNo:3和SEQIDNo:4。試劑盒基于TaqMan探針熒光PCR原理，引物SEQIDNo:1和SEQIDNo:2擴增HPV6,11型的同源共有序列，雙熒光探針SEQIDNo:3和SEQIDNo:4為識別HPV6,11型的同源共有序列，且探針5’端標記FAM熒光基團，提高了檢測靈敏度。試劑盒中的核酸提取試劑基于磁珠法核酸提取原理，能從樣本中快速提取HPVDNA，去除PCR抑制物，獲得的DNA純度高，且適合儀器自動化操作，本專利技術提供的高靈敏HPV6,11型核酸檢測試劑盒能克服現有技術檢測靈敏度低、造成漏檢誤診等問題，適合臨床推廣使用。技術方案通過對GenBank中HPV6,11型病毒基因序列查詢，用VectorNTI、Oligo等軟件對各種來源的基因序列進行比對設計，按照TaqMan熒光PCR設計的原則，優選了一對HPV6,11型序列同源引物擴增這兩種亞型基因片段，同時采用雙熒光探針檢測擴增片段之間這兩種亞型的同源共有序列，試劑盒中的兩條引物和兩條熒光探針核苷酸序列（5’->3’）如下：HPV6,11上游引物：AgATgTggCggCCTAg，序列記為SEQIDNO：1；HPV6,11下游引物：gTCTAgAACTgCTggCATg，序列記為SEQIDNO：2；HPV6,11熒光探針1：CACAgTATATgTgCCTCCTCC，序列記為SEQIDNO：3；HPV6,11熒光探針2：gCATCCgTggCAACAAC，序列記為SEQIDNO：4；兩條熒光探針在序列5’端標記FAM（6-carboxy-fluorescein）熒光基團、3’端標記TAMRA（5-Carboxy-tetramethyl-rhodamine）或BHQ-1（Blackholequencher1）淬滅基團。本試劑盒檢測靶序列選擇HPV6,11型L1基因中兩種亞型的保守同源序列，采用的雙熒光探針檢測擴增片段之間兩種亞型的保守同源序列（分別針對正義、反義鏈），一次PCR反應產生雙倍熒光信號，有利于提高試劑盒檢測靈敏度。所述擴增試劑反應體系各成分組成如下：10mMTris-HCl（pH8.3）、50mMKCl、0.2mMdNTPs（含dATP、dGTP、dCTP、dUTP）、1.5～5mMMgCl2、各0.1～0.5μMHPV6,11型引物和熒光探針（SEQIDNO：1～4）、1～5UTaqDNA聚合酶和0.01～1UUNG酶，提取的模板10μl，總反應體積30μl。更具體的，擴增試劑各成分終濃度為：Tris-HCl（pH8.3）10mM、KCl50mM、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.2mM、MgCl23.5mM、一對HPV6,11型引物0.35μM、兩條熒光探針各0.2μM、TaqDNA聚合酶2U、UNG酶0.5U。所述HPV6,11型熒光PCR試劑盒使用擴增程序如下：50℃2min、94℃5min后按照94℃10sec、60℃45sec循環擴增45次，循環步驟中60℃時采集FAM波長熒光信號。所述HPV6,11型熒光PCR試劑盒對照品包括陽性對照、陰性對照各1個，前者采用SEQIDNO：1和2引物擴增產物序列插入pUC18T載體上的質粒大腸桿菌（簡稱為HPV6,11型質粒大腸桿菌），濃度為103copy/ml；陰性對照采用生理鹽水。所述HPV6,11型熒光PCR試劑盒的核酸提取試劑，它包括裂解緩沖液、磁珠、清洗緩沖液W1、清洗緩沖液W2、洗脫緩沖液這5種組分。其中裂解緩沖液含有50mMTris-HCl（pH8.0）、5M異硫氰酸胍、15%（v/v）TritonX-100。清洗緩沖液W1含有10mMTris-HCl(pH8.0)、30%乙醇。清洗緩沖液W2含有10mMTris-HCl（pH8.0）、80%乙醇。洗脫緩沖液為10mMTris-HCl（pH8.0）溶液。磁珠為表面包裹二氧化硅的微納米磁性顆粒。上述核酸提取試劑在核酸提取儀上能實現樣本核酸自動化提取。通過上述設計獲得含有一對優選HPV6,11型引物和兩條熒光探針的擴增試劑、對照品（陽性對照和陰性對照各一個）、以及核酸提取試劑，其中擴增試劑和對照品-20℃保存，核酸提取試劑室溫保存。試劑盒使用時的操作步驟為：取400μl泌本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種高靈敏人乳頭瘤病毒（HPV）6,11型核酸檢測試劑盒，其特征在于，試劑盒包含核酸擴增試劑、對照品以及核酸提取試劑，擴增試劑所用的一對熒光PCR檢測引物序列為SEQ?ID?No：1和SEQ?ID?No：2，熒光探針序列分別為SEQ?ID?No：3和SEQ?ID?No：4。
【技術特征摘要】
1.一種高靈敏人乳頭瘤病毒（HPV）6,11型核酸檢測試劑盒，其特征在于，試劑盒包含核酸擴增試劑、對照品以及核酸提取試劑，擴增試劑所用的一對熒光PCR檢測引物序列為SEQIDNo：1和SEQIDNo：2，熒光探針序列分別為SEQIDNo：3和SEQIDNo：4。2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，試劑盒擴增試劑中的熒光探針SEQIDNO：3和SEQIDNo：4序列5’端標記FAM熒光基團、3’端標記TAMRA或BHQ-1淬滅基團。3.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，試劑盒核酸擴增試劑分裝加入模板后，反應體系各成分按照以下濃度進行擴增反應：10mMpH8.3的Tris-HCl、50mMKCl、0.2mMdNTPs、1.5～5mMMgCl2、各0.1～0.5μMHPV6,11型引物和熒光探針、1～5UTaqDNA聚合酶和0.01～1UUNG酶。4.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，試劑盒對照品包括陰性對照和陽性對照，陰性對照為生理鹽水，陽性對照為含HPV6,...
【專利技術屬性】
技術研發人員：吳大治，夏懿，吳梅，
申請(專利權)人：上海星耀醫學科技發展有限公司，
類型：發明
國別省市：上海,31
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