D?色氨酸在抑制銅綠假單胞菌產(chǎn)彈性蛋白酶中的應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)了D?色氨酸在抑制銅綠假單胞菌產(chǎn)彈性蛋白酶中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)的D?色氨酸可有效降低彈性蛋白酶的產(chǎn)生，降低銅綠假單胞菌感染的毒性作用,這將為臨床上治療銅綠假單胞菌感染性疾病提供新的有效途徑。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)還公開(kāi)了一種輔助抗銅綠假單胞菌的藥物，所述藥物中含有D?色氨酸。D?色氨酸可用于輔助抗銅綠假單胞菌的藥物中，可以廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷、燒傷、供皮區(qū)以及其它的銅綠假單胞菌感染治療，且起效劑量小，安全性高，應(yīng)用人群廣。

D tryptophan in inhibiting elastase production application in Pseudomonas aeruginosa

The invention discloses a D tryptophan in inhibiting elastase production application in Pseudomonas aeruginosa, which belongs to the field of biomedical technology. D tryptophan of the invention can effectively reduce elastase production, reduce toxicity of Pseudomonas aeruginosa infection, which will provide a new and effective way for the clinical treatment of infectious diseases of Pseudomonas aeruginosa. The invention also discloses a medicine adjuvant against Pseudomonas aeruginosa, the drug containing D tryptophan. D tryptophan can be used for adjuvant anti Pseudomonas aeruginosa, can be widely used in trauma, burns, donor sites and other Pseudomonas aeruginosa infection treatment, and the effect of small dosage, high safety, wide application of the crowd.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
D-色氨酸在抑制銅綠假單胞菌產(chǎn)彈性蛋白酶中的應(yīng)用
本專(zhuān)利技術(shù)涉及D-色氨酸在抑制銅綠假單胞菌產(chǎn)彈性蛋白酶中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)

技術(shù)介紹
D-色氨酸(D-tryptophan，D-Trp)是一種淺褐色的晶體，分子式是C11H12N2O2，分子量204.23g/mol，熔點(diǎn)是282-285℃。D-色氨酸的分子結(jié)構(gòu)圖如圖1所示。銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)是臨床常見(jiàn)的多重耐藥菌，除了頑強(qiáng)的耐藥性，銅綠假單胞菌自身還能產(chǎn)生產(chǎn)生多種毒力因子，包括綠膿菌素、彈性蛋白酶、鼠李糖脂、凝集素等，對(duì)患者有明顯的毒副作用。其中彈性蛋白酶主要由基因lasB編碼合成，其毒性作用主要體現(xiàn)在降解免疫系統(tǒng)中的蛋白成分物質(zhì)，包括補(bǔ)體C3、激肽原、抗菌肽、細(xì)胞因子、免疫球蛋白、表面活性蛋白、蛋白多糖、細(xì)菌鞭毛蛋白等，大大破壞機(jī)體的免疫機(jī)制；能損傷組織細(xì)胞，抑制纖維母細(xì)胞的生長(zhǎng)，導(dǎo)致PA的感染患者慢性潰瘍的產(chǎn)生；可通過(guò)降解調(diào)理素來(lái)抵抗表面活性蛋白-A介導(dǎo)的自噬作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)的目的之一，是提供D-色氨酸在抑制銅綠假單胞菌產(chǎn)彈性蛋白酶中的應(yīng)用。D-色氨酸可有效降低銅綠假單胞菌彈性蛋白酶的產(chǎn)生，降低銅綠假單胞菌感染的毒性作用，這將為臨床上治療銅綠假單胞菌感染性疾病提供新的有效途徑。本專(zhuān)利技術(shù)解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下：D-色氨酸在抑制銅綠假單胞菌產(chǎn)彈性蛋白酶中的應(yīng)用。專(zhuān)利技術(shù)的申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，D-色氨酸對(duì)銅綠假單胞菌產(chǎn)彈性蛋白酶抑制率：D-色氨酸濃度為5mM時(shí)的抑制率>20％，D-色氨酸濃度為10mM時(shí)的抑制率>23％。由此可見(jiàn)，D-色氨酸可有效降低銅綠假單胞菌彈性蛋白酶的產(chǎn)生，降低銅綠假單胞菌感染的毒性作用，為臨床上治療銅綠假單胞菌感染性疾病提供新的有效途徑。本專(zhuān)利技術(shù)的目的之二，是提供一種輔助抗銅綠假單胞菌的藥物。D-色氨酸可用于輔助抗銅綠假單胞菌的藥物中，可以廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷、燒傷、供皮區(qū)以及其它的銅綠假單胞菌感染治療，且安全性高，應(yīng)用人群廣。本專(zhuān)利技術(shù)解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下：一種輔助抗銅綠假單胞菌的藥物，所述藥物中含有D-色氨酸。在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本專(zhuān)利技術(shù)還可以做如下改進(jìn)。進(jìn)一步，所述藥物的劑型為乳劑、膏劑或溶液劑。采用上述進(jìn)一步的有益效果是：將D-色氨酸制成更多劑型，并應(yīng)用在醫(yī)用材料上，能更廣泛的發(fā)揮D-色氨酸抑制銅綠假單胞菌感染后彈性蛋白酶的產(chǎn)生，減少銅綠假單胞菌的毒性作用，為銅綠假單胞菌感染更優(yōu)選的治療方法。本專(zhuān)利技術(shù)的有益效果是：1.D-色氨酸可有效降低銅綠假單胞菌彈性蛋白酶的產(chǎn)生，降低銅綠假單胞菌感染的毒性作用。2.D-色氨酸對(duì)銅綠假單胞菌產(chǎn)彈性蛋白酶抑制率：D-色氨酸濃度為5mM時(shí)的抑制率>20％，D-色氨酸濃度為10mM時(shí)的抑制率>23％。3.D-色氨酸可作為一種抗菌輔劑起效劑量小，安全性高。4.D-色氨酸可用于輔助抗銅綠假單胞菌的藥物中，可以廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷、燒傷、供皮區(qū)以及其它的銅綠假單胞菌感染治療，且起效劑量小，安全性高，應(yīng)用人群廣。附圖說(shuō)明圖1是本專(zhuān)利技術(shù)D-色氨酸的分子結(jié)構(gòu)圖。圖2是本專(zhuān)利技術(shù)D-色氨酸對(duì)銅綠假單胞菌PAO1產(chǎn)彈性蛋白酶的影響。圖3是彈性蛋白酶的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)。圖4是本專(zhuān)利技術(shù)D-色氨酸對(duì)銅綠假單胞菌PAO1中l(wèi)asB基因表達(dá)的影響。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體附圖對(duì)本專(zhuān)利技術(shù)的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本專(zhuān)利技術(shù)，并非用于限定本專(zhuān)利技術(shù)的范圍。實(shí)施例1將-80℃保存的銅綠假單胞菌PAO1劃板接種至LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h。挑取約1mm2的單克隆菌落至LB液體培養(yǎng)基中，200r/min，37℃培養(yǎng)6-8h。用新鮮PTSB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨50g、TSB培養(yǎng)基2.5g，加超純水定容至1000ml，調(diào)節(jié)pH至7.2-7.4，121℃高溫滅菌30min),將D-色氨酸溶至10mM，再用培養(yǎng)基依次稀釋。將含不同濃度的D-色氨酸10、5、1、0.1、0mM的LB培養(yǎng)基分別取2ml于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2μl0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊你~綠假單胞菌PAO1菌液，各濃度做3個(gè)復(fù)孔。37℃培養(yǎng)24h。吸取待測(cè)菌液，4℃、12000rpm離心5min，吸取200μl上清液于新的EP管，加入800μl彈性蛋白酶反應(yīng)緩沖液(Tris-HCl0.1M，CaCl21mM)及2mg剛果紅底物。30℃振蕩培養(yǎng)24h后離心去除多余的剛果紅底物，取200μl液體測(cè)OD495。按上述操作進(jìn)行彈性蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品工作曲線(xiàn)的測(cè)定(圖3)，經(jīng)濃度換算后，D-色氨酸對(duì)銅綠假單胞菌PAO1產(chǎn)彈性蛋白酶的影響見(jiàn)圖2，D-色氨酸濃度為5mM時(shí)的PAO1產(chǎn)彈性蛋白酶的抑制率>20％，D-色氨酸濃度為10mM時(shí)的抑制率>23％。實(shí)施例2將銅綠假單胞菌PAO1按實(shí)施例1中步驟培養(yǎng)，收集菌液后離心，所得沉淀按照RNeasyMiniKit提取試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作流程提取各組的RNA，測(cè)定各組RNA濃度后，按體系配比(20μl體系：PrimescriptRtmastermix4μl、cDNA1μg、超純水添至20μl)進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄。經(jīng)普通PCR驗(yàn)證cDNA能擴(kuò)增彈性蛋白酶編碼基因lasB(具體序列見(jiàn)表1)，下一步進(jìn)行熒光定量PCR。配制20μl體系包括：PremixExTorqⅡ10μl，上下游引物各0.8μl，cDNA稀釋10倍后取2μl，超純水6.4μl。反應(yīng)條件為：95℃5S，(95℃5S，61℃30S，72℃20S)×40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用管家基因rpsL的量歸一化后再進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。結(jié)果見(jiàn)圖4，發(fā)現(xiàn)D-色氨酸能下調(diào)銅綠假單胞菌中彈性蛋白酶編碼基因lasB及其上游控制基因lasI和lasR的表達(dá)。表1PCR相關(guān)引物匯總表由此可見(jiàn)，D-色氨酸可有效降低銅綠假單胞菌綠膿菌素及彈性蛋白酶的產(chǎn)生。實(shí)施例3一種輔助抗銅綠假單胞菌的藥物，所述藥物中含有D-色氨酸。所述藥物的劑型為乳劑、膏劑或溶液劑。以上所述僅為本專(zhuān)利技術(shù)的較佳實(shí)施例，并不用以限制本專(zhuān)利技術(shù)，凡在本專(zhuān)利技術(shù)的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本專(zhuān)利技術(shù)的保護(hù)范圍之內(nèi)。本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
D?色氨酸在抑制銅綠假單胞菌產(chǎn)彈性蛋白酶中的應(yīng)用。

【技術(shù)特征摘要】
1.D-色氨酸在抑制銅綠假單胞菌產(chǎn)彈性蛋白酶中的應(yīng)用。2.一種輔助抗銅綠假單胞菌的藥物，其特征在于，所述藥物中含有...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：蔡挺，張順，費(fèi)秋萍，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：蔡挺，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：浙江,33