金屬硫蛋白的制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種金屬硫蛋白的制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明專利技術(shù)將植物經(jīng)金屬鹽水溶液進(jìn)行誘導(dǎo)后再經(jīng)汽爆處理，并在一定壓力、溫度、惰性氣氛下分離提純，用常溫型α?淀粉酶進(jìn)行酶解最終得到金屬硫蛋白成品。本發(fā)明專利技術(shù)選用小喬木、大葉作物、瓜秧等材料，經(jīng)誘導(dǎo)后制備出高含量、高質(zhì)量的金屬硫蛋白，并且本發(fā)明專利技術(shù)采用在常溫、高壓下的汽爆方法，通過由內(nèi)而外的沖擊力沖破細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物（包含金屬硫蛋白）全部“破壁而出”，利于下一步的分離操作，并應(yīng)用了特殊的生物酶，保證了本發(fā)明專利技術(shù)對(duì)誘導(dǎo)植物利用的高效率、高質(zhì)量、高收益。生產(chǎn)工藝簡單、易于操作和技術(shù)推廣。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
金屬硫蛋白的制備方法
本專利技術(shù)涉及生物
，特別涉及一種金屬硫蛋白的制備方法。
技術(shù)介紹
金屬硫蛋白（metallothionein）是由微生物和動(dòng)、植物產(chǎn)生的金屬結(jié)合蛋白，是一種低分子量、高巰基含量、能大量結(jié)合重金屬離子的蛋白質(zhì)，因此稱為金屬硫蛋白（簡稱MT）。根據(jù)研究，金屬硫蛋白的重要生理功能表現(xiàn)在它是一種目前已知的最有效的自由基清除劑。其清除氫氧根自由基（?OH）的能力約為SOD的幾千倍，而清除氧自由基（?O）的能力約是谷胱甘肽（GSH）的25倍，而且具有很強(qiáng)的抗氧化活性；并由此衍生出抗腫瘤、預(yù)防心腦血管疾病及帕金森癥等生理功能。金屬硫蛋白在醫(yī)藥品、保健品、化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。目前金屬硫蛋白的主要來源為兔肝。由于擔(dān)心人畜橫向傳染疾病，動(dòng)物源的金屬硫蛋白在歐美地區(qū)已逐步被禁用。因此，開發(fā)更具安全性的植物源的金屬硫蛋白已是當(dāng)務(wù)之急。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專利技術(shù)提供了一種金屬硫蛋白的制備方法。本專利技術(shù)的技術(shù)方案為：一種金屬硫蛋白的制備方法，包括步驟：A原料準(zhǔn)備1）誘導(dǎo)植物：將誘導(dǎo)劑澆根或噴施于植物葉面，平均劑量控制在5—30毫克/千克干基植物；連用5—20天，隔天施用1次，每次劑量較上一次高0.3—3倍；2）將上述誘導(dǎo)后的植物經(jīng)除雜、揉絲、切段、干燥、粉碎后置入汽爆罐中，粉末加入量達(dá)到罐體容積的5—40%，用空壓機(jī)緩緩?fù)ㄈ攵栊詺怏w排凈罐內(nèi)空氣后封閉；不斷加壓至1—5MPa，保壓20—120分鐘；噴放到密封噴放倉，得汽爆粉末；充入惰性氣體保存、備用；B金屬硫蛋白的制備3）汽爆粉末入提取罐中，加入1—20倍體積的Tris-HCl緩沖液，Tris-HCl緩沖液的質(zhì)量濃度為0.01~0.1mol/L，用空壓機(jī)通入惰性氣體，攪勻后，提取10—60分鐘；4）將步驟3）中提取罐內(nèi)的混合溶液離心分離，取上清；靜置1—3小時(shí)，澄清處理，然后通過超濾、納濾分離系統(tǒng)，得到分子量介于10000至15000道爾頓的金屬硫蛋白粗液；5）將上述金屬硫蛋白粗液移入酶解罐，加入常溫型α-淀粉酶，間歇1分鐘，通入惰性氣體1分鐘；酶解10—80分鐘；所述常溫型α-淀粉酶由微波誘導(dǎo)所得變異地衣芽孢桿菌分泌所得α-淀粉酶，所述常溫型α-淀粉酶的適宜溫度為22-35℃；6）將步驟5）酶解后的液體移入冷凍離心機(jī)高速離心，取上清；7）將上清直接上SephadexG-50柱層析進(jìn)行分離，以0.005~0.05mol/LTris-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫，收集含金屬硫蛋白組分的洗脫液；8）將步驟7）中收集的洗脫液進(jìn)行真空濃縮，濃縮后的剩余部分用Tris-HCl緩沖液洗滌1~5遍，重復(fù)本步驟，得金屬硫蛋白；經(jīng)干燥、粉碎后得金屬硫蛋白成品。其中，選取的誘導(dǎo)植物為灌木、小喬木、大葉作物、瓜秧等；瓜秧包括其莖、葉。進(jìn)一步，步驟1）中所述誘導(dǎo)劑為金屬鹽類水溶液，誘導(dǎo)劑水溶液質(zhì)量濃度為10—50%。步驟1）中所述誘導(dǎo)劑包括銅、鐵、鋅、錳的硫酸鹽、硝酸鹽或氯化物中的一種或多種混合物。其中，步驟5）中，所述微波誘導(dǎo)所得變異地衣芽孢桿菌的獲取步驟具體為：將地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)液置于微波發(fā)生器，設(shè)置微波功率為850-950W，脈沖頻率為2300MHz，微波處理20s，冷卻20s，依此往復(fù)25-35次；將微波處理后的培養(yǎng)液涂布在固體培養(yǎng)基上，30℃條件下培養(yǎng)1-2天，由存活下來的菌落中篩選四株常溫下α-淀粉酶活性高的地衣芽孢桿菌的變異菌株。選出常溫下α-淀粉酶性最高的地衣芽孢桿菌的變異菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，從而獲得所述常溫型α-淀粉酶。上述所述常溫型α-淀粉酶的加入量滿足每升金屬硫蛋白粗液30-70U。進(jìn)一步，所述惰性氣體為氮?dú)狻⒑饣驓鍤狻＿M(jìn)一步，所述Tris-HCl緩沖液pH6~10。進(jìn)一步，步驟8）中所述干燥為噴霧干燥、熱風(fēng)干燥、流化床干燥或冷凍干燥。本專利技術(shù)的有益效果為：本專利技術(shù)選用小喬木、大葉作物、瓜秧等材料，經(jīng)誘導(dǎo)后制備出高含量、高質(zhì)量的金屬硫蛋白，并且本專利技術(shù)采用在常溫、高壓下的汽爆方法，通過由內(nèi)而外的沖擊力沖破細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物（包含金屬硫蛋白）全部“破壁而出”，利于下一步的分離操作，并應(yīng)用了特殊的生物酶，保證了本專利技術(shù)對(duì)誘導(dǎo)植物利用的高效率、高質(zhì)量、高收益。生產(chǎn)工藝簡單、易于操作和技術(shù)推廣。具體實(shí)施方式實(shí)施例11）選擇高山綠茶樹作為制備植物源金屬硫蛋白的材料，選用硫酸鋅作為誘導(dǎo)劑，首先配制質(zhì)量濃度15%的硫酸鋅溶液，然后采取噴施于茶樹葉面的方法，平均劑量控制在10毫克鋅/千克干基茶樹；連用10天，隔天施用1次，每次劑量較上一次高0.5倍；2）收獲誘導(dǎo)后的茶葉，入廠后除雜、揉絲、粉碎；置入汽爆罐中，加入量達(dá)到罐體容積的25%，用空壓機(jī)緩緩?fù)ㄈ攵栊詺怏w，如氦氣、氬氣或氮?dú)獾龋艃艄迌?nèi)空氣后封閉；不斷加壓至2MPa，保壓90分鐘；噴放到密封噴放倉，得茶葉汽爆粉末；充入惰性氣體保存、備用；此處利用高壓氣體在噴放過程中產(chǎn)生的由內(nèi)而外的沖擊力沖破細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物（含有金屬硫蛋白）全部“破壁而出”，利于下一步的分離操作；3）將茶葉汽爆粉末入提取罐中，加入10倍體積的Tris-HCl緩沖液，Tris-HCl緩沖液的質(zhì)量濃度為0.03mol/L，用空壓機(jī)通入惰性氣體，如氦氣、氬氣或氮?dú)獾龋瑪噭颍崛?0分鐘；4）將步驟3）中提取罐內(nèi)的混合溶液離心分離，取上清；靜置1.5小時(shí)，澄清處理，然后通過超濾、納濾分離系統(tǒng)，得到分子量介于10000至15000道爾頓的金屬硫蛋白粗液；5）將上述金屬硫蛋白粗液移入酶解罐，加入常溫型α-淀粉酶，間歇1分鐘，通入惰性氣體1分鐘；酶解40分鐘；所述常溫型α-淀粉酶由微波誘導(dǎo)所得變異地衣芽孢桿菌分泌所得α-淀粉酶，所述常溫型α-淀粉酶的適宜溫度為22-35℃；常溫型α-淀粉酶加入量為40U/升金屬硫蛋白粗液。6）將步驟5）酶解后的液體移入冷凍離心機(jī)高速離心，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，取上清；7）將上清直接上SephadexG-50柱層析進(jìn)行分離，以0.015mol/LTris-HCl緩沖液（pH8.5）進(jìn)行洗脫，收集含金屬硫蛋白組分的洗脫液；8）將步驟7）中收集的洗脫液進(jìn)行真空濃縮，濃縮后的剩余部分用Tris-HCl緩沖液洗滌3遍，重復(fù)本步驟，得金屬硫蛋白；經(jīng)冷凍干燥、粉碎后得金屬硫蛋白成品。步驟5）中常溫型α-淀粉酶由微波誘導(dǎo)所得變異地衣芽孢桿菌分泌所得α-淀粉酶；微波誘導(dǎo)所得變異地衣芽孢桿菌的獲取步驟具體為：將地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)液置于微波發(fā)生器，設(shè)置微波功率為900W，脈沖頻率為2300MHz，微波處理20s，冷卻20s，依此往復(fù)30次；將微波處理后的培養(yǎng)液涂布在固體培養(yǎng)基上，30℃條件下培養(yǎng)1-2天，由存活下來的菌落中篩選四株常溫下α-淀粉酶活性高的地衣芽孢桿菌的變異菌株。選出常溫下α-淀粉酶活性最高的地衣芽孢桿菌的變異菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，從而獲得常溫型α-淀粉酶；常溫型α-淀粉酶在22-35℃溫度下高效率地水解淀粉，不必像目前大多采用的高溫型α-淀粉酶需要高溫（80-90℃）條件，因而減少了能耗也降低了對(duì)設(shè)備的要求；此處用酶法可以柔和地脫除淀粉，避免了淀粉對(duì)下一步柱層析的影響；經(jīng)測(cè)定，本實(shí)施例所得茶葉金屬硫蛋白的質(zhì)量為茶葉干基質(zhì)量的0.084%、純度為95.5%（達(dá)到了精品級(jí)）。實(shí)施例21）選擇高地西瓜秧（包括葉子）作為制本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種金屬硫蛋白的制備方法，其特征在于，包括步驟：A原料準(zhǔn)備1）誘導(dǎo)植物：將誘導(dǎo)劑澆根或噴施于植物葉面，平均劑量控制在5—30毫克/千克干基植物；連用5—20天，隔天施用1次，每次劑量較上一次高0.3—3倍；2）將上述誘導(dǎo)后的植物經(jīng)除雜、揉絲、切段、干燥、粉碎后置入汽爆罐中，粉末加入量達(dá)到罐體容積的5—40%，用空壓機(jī)緩緩?fù)ㄈ攵栊詺怏w排凈罐內(nèi)空氣后封閉；不斷加壓至1—5MPa，保壓20—120分鐘；噴放到密封噴放倉，得汽爆粉末；充入惰性氣體保存、備用；B金屬硫蛋白的制備3）汽爆粉末入提取罐中，加入1—20倍體積的Tris?HCl緩沖液，Tris?HCl緩沖液的質(zhì)量濃度為0.01~0.1mol/L，用空壓機(jī)通入惰性氣體，攪勻后，提取10—60分鐘；4）將步驟3）中提取罐內(nèi)的混合溶液離心分離，取上清；靜置1—3小時(shí)，澄清處理，然后通過超濾、納濾分離系統(tǒng)，得到分子量介于10000至15000道爾頓的金屬硫蛋白粗液；5）將上述金屬硫蛋白粗液移入酶解罐，加入常溫型α?淀粉酶，間歇1分鐘，通入惰性氣體1分鐘；酶解10—80分鐘；所述常溫型α?淀粉酶由微波誘導(dǎo)所得變異地衣芽孢桿菌分泌所得α?淀粉酶，所述常溫型α?淀粉酶的適宜溫度為22?35℃；6）將步驟5）酶解后的液體移入冷凍離心機(jī)高速離心，取上清；7）將上清直接上Sephadex?G?50柱層析進(jìn)行分離，以0.005~0.05?mol/L?Tris?HCl緩沖液進(jìn)行洗脫，收集含金屬硫蛋白組分的洗脫液；8）將步驟7）中收集的洗脫液進(jìn)行真空濃縮，濃縮后的剩余部分用Tris?HCl緩沖液洗滌1~5遍，重復(fù)本步驟，得金屬硫蛋白；經(jīng)干燥、粉碎后得金屬硫蛋白成品。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種金屬硫蛋白的制備方法，其特征在于，包括步驟：A原料準(zhǔn)備1）誘導(dǎo)植物：將誘導(dǎo)劑澆根或噴施于植物葉面，平均劑量控制在5—30毫克/千克干基植物；連用5—20天，隔天施用1次，每次劑量較上一次高0.3—3倍；2）將上述誘導(dǎo)后的植物經(jīng)除雜、揉絲、切段、干燥、粉碎后置入汽爆罐中，粉末加入量達(dá)到罐體容積的5—40%，用空壓機(jī)緩緩?fù)ㄈ攵栊詺怏w排凈罐內(nèi)空氣后封閉；不斷加壓至1—5MPa，保壓20—120分鐘；噴放到密封噴放倉，得汽爆粉末；充入惰性氣體保存、備用；B金屬硫蛋白的制備3）汽爆粉末入提取罐中，加入1—20倍體積的Tris-HCl緩沖液，Tris-HCl緩沖液的質(zhì)量濃度為0.01~0.1mol/L，用空壓機(jī)通入惰性氣體，攪勻后，提取10—60分鐘；4）將步驟3）中提取罐內(nèi)的混合溶液離心分離，取上清；靜置1—3小時(shí)，澄清處理，然后通過超濾、納濾分離系統(tǒng)，得到分子量介于10000至15000道爾頓的金屬硫蛋白粗液；5）將上述金屬硫蛋白粗液移入酶解罐，加入常溫型α-淀粉酶，間歇1分鐘，通入惰性氣體1分鐘；酶解10—80分鐘；所述常溫型α-淀粉酶由微波誘導(dǎo)所得變異地衣芽孢桿菌分泌所得α-淀粉酶，所述常溫型α-淀粉酶的適宜溫度為22-35℃；6）將步驟5）酶解后的液體移入冷凍離心機(jī)高速離心，取上清；7）將上清直接上SephadexG-50柱層析進(jìn)行分離，以0.005~0.05mol/LTris-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫，收集含金屬硫蛋白組分的洗脫液；8）將步驟7）中收集的洗脫液進(jìn)行真空濃縮，濃縮后的剩余部分用Tris-HCl緩沖液洗滌1~5遍，重復(fù)本步驟，得金屬硫...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：曹吉祥，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：濟(jì)南米鐸碳新能源科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：山東,37