制備植物來源的VLP的方法技術

提供了制備植物來源之病毒樣顆粒(virus?like?particle，VLP)的方法。該方法可包括獲取包含定位于質外體(apoplast)之VLP的植物或植物物質，從所述植物或植物物質產生原生質體(protoplast)/原生質球(spheroplast)級分和質外體級分，以及回收質外體級分。質外體級分包含植物來源的VLP。或者，可以通過用細胞壁降解酶組合物消化植物物質來產生消化級分，從而從包含植物來源之VLP的植物或植物物質獲得VLP。過濾消化級分以產生過濾級分，從過濾級分中回收植物來源的VLP。

【技術實現步驟摘要】
制備植物來源的VLP的方法本申請是中國專利申請CN201080042333.0的分案申請，原申請是國際申請號PCT/CA2010/001488于2012年3月22日進入中國國家階段的申請。
本專利技術涉及制備植物來源的病毒樣顆粒(viruslikeparticle，VLP)的方法。
技術介紹
目前宿主細胞(如大腸桿菌、昆蟲細胞培養物和哺乳動物細胞培養物)中的重組表達策略在培養基中以非常高的水平表達和分泌蛋白質。使用這些系統獲得了高水平表達、正確蛋白質折疊和蛋白質翻譯后修飾。此外，由于可以容易地將細胞內蛋白質與其他組分(DNA、囊泡、膜、色素等)分離，所表達蛋白質的純化得以簡化。對于植物或酵母表達系統，細胞壁阻止表達的蛋白質分泌到培養基中。對抗病毒感染的一種主要方法是通過免疫接種。應對流行爆發或滿足季節性需求(例如，每年秋季發生的“流感季”或最近全球爆發的“豬流感”)的疫苗生產需要在獲知后短時間內生產足量的疫苗。在面對全球流感大流行時，目前全球的流感疫苗產量可能不足。此外，主導(dominant)流感毒株每年變化，因此在一年中的低需求時間中儲備是不實際的。經濟、大規模地生產有效的流感疫苗有顯著價值。病毒樣顆粒(VLP)可用于制備流感疫苗。超結構(suprastructure)(如VLP)模擬病毒衣殼結構，但缺少基因組，從而不能復制或提供再次感染。VLP刺激強免疫應答，為分離(可溶)的重組抗原提供了替代方法。VLP在特定病毒蛋白表達后進行組裝并具有類似于其同類病毒的外表面，但不同于真的病毒顆粒，遺傳物質不會整合到其中。與天然病毒類似的顆粒狀多價結構抗原的呈遞引發具有均衡的體液和細胞成分的增強的免疫應答刺激。認為優于分離抗原產生之刺激的這種改進對于包膜病毒尤其適用，因為包膜VLP以其天然膜結合狀態呈遞表面抗原(Grgacic和Anderson，2006年，Methods40，60-65)。此外，已證明與重組血凝素(HA)(即單體HA，或組成花環的HA；3-8個三聚體的HA組裝物)相比，擁有納米顆粒組織結構的流感VLP是更佳的候選疫苗，并且他們能激活體液和細胞免疫應答。(Bright，R.A.，等，2007，Vaccine25，3871-3878)。目前市場上的絕大部分流感疫苗由從蛋中培養之病毒粒獲得的病毒顆粒或病毒抗原構成。來源于蛋的疫苗的生產依賴于在具有胚胎的雞蛋中培養活病毒。在用去污劑化學滅活和破壞純化的病毒粒后獲得裂解流感疫苗。作為大流行性疫苗產品，重組流感抗原是病毒來源抗原的有效替代品。一旦可獲得新毒株的遺傳構成信息，可以使用該信息生產重組抗原，并且其允許快速啟動生產過程。但是，與滅活的裂解流感疫苗相比，純化的重組HA亞基表現出更低的效力，并且需要更高的抗原含量來產生強免疫應答(Treanor等，2007，J.Am.Med.Assoc.297，1577-1582)。已通過在培養的哺乳動物細胞中共表達全部10種流感病毒蛋白獲得流感VLP(Mena等，1996年，J.Virol.70，5016-5024)。幾種病毒蛋白對于VLP的生產是可缺省的，而且在疫苗發展中已通過共表達2種主要抗原性包膜蛋白(HA和NA)以及M1或者僅共表達HA和M1生產流感VLP(Kang等，2009年，VirusRes.143，140-146)。Chen等(2007年，J.Virol.81，7111-7123)證實單獨的HA可以驅動VLP形成和出芽，在他們的系統中可以省去M1共表達。但是，由于發現HA與產生VLP的哺乳動物細胞表面的唾液酸化糖蛋白結合，所以共表達了病毒唾液酸酶以使VLP在出芽后從生產細胞中釋放。期望有更簡單的VLP生產系統(例如依賴于表達僅一種或幾種病毒蛋白質而不需要表達非結構病毒蛋白的生產系統)以加快疫苗的開發。在植物系統中生產病毒抗原(包括VLP)提供了這樣的生產優勢，既它們可以在溫室或田間培養，不需要無菌組織培養法和處理。PCT公開WO2006/119516(Williamson和Rybicki)公開了在植物中表達流感病毒A/越南/1194/2004的全長和截短的人密碼子優化H5HA。截短的構建體缺少膜錨定結構域。通過靶向ER的構建體獲得最高的HA蛋白積累。缺少膜靶向結構域的構建體沒有產生可檢測的HA。沒有報道VLP的生產情況。之前WO2009/009876和WO2009/076778的專利技術人已描述了包含脂質包膜的流感HAVLP的生產(D'Aoust等；兩者均通過引用并入本文)。對于包膜病毒，病毒保留脂質層或膜可以是有利的。不同系統的脂質構成可以有所不同(例如植物生成的包膜病毒會在包膜中包含植物脂質或植物甾醇)，這可有助于增強免疫應答。Mason等描述了表達HBV表面抗原(HBsAg)的轉基因煙草中包膜VLP的組裝(1992年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89，11745-11749)。已證明植物生成的HBVVLP在腸胃外施用時在小鼠中顯示出誘導強B和T細胞免疫應答((Huang等，2005年，Vaccine23，1851-1858)，但飼喂實驗的口服免疫僅誘導了中度的免疫應答(Smith等，2003年，Vaccine21，4011-4021)。Greco(2007年，Vaccine25，8228-8240)證明與HBsAg融合的人免疫缺陷病毒(HIV)表位在轉基因煙草和擬南芥(Arabidopsis)中表達時累積為VLP，產生了二價VLP疫苗。在轉基因煙草和馬鈴薯植株中表達病毒衣殼蛋白(NVCP)導致無包膜VLP的組裝(Mason等，1996年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93，5335-5340)。已在農桿菌浸潤的本塞姆氏煙草(N.benthamiana)葉中產生了NVCPVLP(Huang等2009年，Biotechnol.Bioeng.103，706-714)，并且在小鼠中證實了其口服施用后的免疫原性(Santi等，2008年，Vaccine26，1846-1854)。給健康成人志愿者施用含有215-751μgVLP形式的NVCP的2或3劑量生馬鈴薯在95％的免疫志愿者中產生免疫應答(Tacket等2000年，J.Infect.Dis.182，302-305)。還由HBV核心抗原(HBcAg；Huang等，2009年，Biotechnol.Bioeng.103，706-714)、人乳頭狀瘤病毒(HPV)主要衣殼蛋白L1(Varsani等，2003年，Arch.Virol.148，1771-1786)的表達獲得了無包膜VLP。可期望在將VLP用于疫苗制備之前從植物或植物物質中存在的一些或全部蛋白質、碳水化合物等中分離VLP。PCT公開WO00/09725(Turpen等)描述了一種從植物的細胞間隙提取蛋白質的方法，包括真空和離心處理以提供包含目的蛋白質的間質液(interstitialfluid)提取物。該方法適于能在真空和離心條件下通過孔的小蛋白質(50kDa或更小)，但不適于較大超級結構蛋白(superstructureprotein)或蛋白復合物如VLP。1999年McCormick等(ProcNatlAcadSciUSA96：703-708)公開了本文檔來自技高網...

【技術保護點】
制備植物來源的病毒樣顆粒(VLP)的方法，其包括：a.獲取包含定位于質外體的VLP的植物或植物物質；其中所述植物物質由整個植物、植物的葉、葉的碎片、粉碎的葉、莖、果實、根或其組合組成；b.通過用基本由纖維素酶組成的細胞壁降解酶混合物或者基本由一種或多于一種纖維素酶和果膠酶組成的細胞壁降解酶混合物處理所述植物或植物物質來產生原生質體/原生質球級分和質外體級分，其中纖維素酶和果膠酶的比例為約2∶1至1∶0.25(v/v)；和，c.回收所述質外體級分，所述質外體級分包含所述植物來源的VLP。

【技術特征摘要】
2009.09.22 US 61/244,7861.制備植物來源的病毒樣顆粒(VLP)的方法，其包括：a.獲取包含定位于質外體的VLP的植物或植物物質；其中所述植物物質由整個植物、植物的葉、葉的碎片、粉碎的葉、莖、果實、根或其組合組成；b.通過用基本由纖維素酶組成的細胞壁降解酶混合物或者基本由一種或多于一種纖維素酶和果膠酶組成的細胞壁降解酶混合物處理所述植物或植物物質來產生原生質體/原生質球級分和質外體級分，其中纖維素酶和果膠酶的比例為約2∶1至1∶0.25(v/v)；和，c.回收所述質外體級分，所述質外體級分包含所述植物來源的VLP。2.權利要求1的方法，其中所述一種或多于一種果膠酶的濃度為0.01％v/v至2.5％v/v。3.權利要求1的方法，其中所述一種或多于一種纖維素酶的濃度為0.1至5％w/v。4.權利要求1的方法，其中所述細胞壁降解酶混合物不包含脂肪酶或蛋白酶中的一種或更多種。5.權利要求1的方法，其中在所述獲取步驟(步驟a)中，用包含編碼選自以下組的蛋白質之核苷酸序列的核酸轉化所述植物：病毒包膜蛋白、病毒結構蛋白、病毒衣殼蛋白和病毒外殼蛋白，以及收集所述植物或植物物質。6.權利要求5的方法，其中所述核酸以瞬時方式引入所述植物中。7.權利要求5的方法，其中所述核酸穩定整合進所述植物的基因組。8.權利要求1的方法，其中在所述獲取步驟(步驟a)中，培養所述植物并收集所述植物或植物物質。9.權利要求5的方法，其中所述核酸編碼流感血凝素。10.權利要求1的方法，其中所述植物來源的病毒樣顆粒(VLP)不包含神經氨酸酶或M蛋白。11.權利要求1的方法，其中所述植物物質是葉、葉的碎片或者粉碎的葉。12.權利要求1的方法，其還包括步驟d)從所述質外體級分中純化所述植物來源的病毒樣顆粒(VLP)。13.權利要求12的方法，其中所述純化步驟包括利用深層過濾來過濾所述質外體級分以產生澄清的提取物，然后用陽離子交換樹脂來層析所述澄清的提取物。14.制備包含植物來源之脂質包膜的植物來源病毒樣顆粒(VLP)的方法，其包括：a.獲取包含定位于質外體的VLP的植物或植物物質；其中所述植物物質由整個植物、植物的葉、葉的碎片、粉碎的葉、莖、果實、根或其組合組成；b.用基本由纖維素酶組成的細胞壁降解酶混合物或者基本由一種或多于一種纖維素酶和果膠酶組成的細胞壁降解酶混合物處理所述植物或植物物質，以產生原生質體/原生質球級分和一種或多于一種包含所述VLP的質外體蛋白復合物，其中纖維素酶和果膠酶的比例為約2∶1至1∶0.25(v/v)；以及c.將所述一種或多于一種質外體蛋白復合物與所述原生質體/原生質球級分分離。15.權利要求14的方法，其中所述一種或多于一種果膠酶的濃度為0.01％v/v至2.5％v/v。16.權利要求14的方法，其中所述一種或多于一種纖維素酶的濃度為0.1％至5.0％w/v。17.權利要求14的方法，其中所述酶混合物不包含脂肪酶或蛋白酶中的一種或更多種。18.權利要求1...

【專利技術屬性】
技術研發人員：路易斯菲利普·韋齊納，馬農·科圖雷，達尼·帕克特，米凱萊·達吉斯，馬克安德烈·德奧斯特，
申請(專利權)人：麥迪卡格公司，
類型：發明
國別省市：加拿大,CA