一種同時檢測多種真菌毒素的方法技術

本發明專利技術涉及真菌毒素檢測的技術領域，具體涉及一種同時檢測多種真菌毒素的方法，包括將樣品加入到提取劑中，振蕩離心，得到殘渣和樣品的上清液；向殘渣中加入甲醇和純水，取殘渣的上清液；將樣品的上清液與殘渣的上清液混合為上清液；混合上清液和稀釋液，過濾得到提取液；將提取液緩慢通過復合免疫親和柱并排干，進行至少兩次的梯度洗脫并收集洗脫液；將洗脫液用氮氣吹干，定容后得到待測液；采用液相色譜質譜聯用同時檢測待測液中真菌毒素的含量，分別繪制每種真菌毒素的標準曲線，最終計算出樣品中真菌毒素的含量。本發明專利技術解決了現有的真菌毒素檢測方法只能檢測單一毒素的缺陷，檢測成本低，提高了檢測效率，減少了試劑損耗和污染。

【技術實現步驟摘要】
一種同時檢測多種真菌毒素的方法
本專利技術涉及真菌毒素檢測的
，具體涉及一種同時檢測多種真菌毒素的方法。
技術介紹
真菌毒素是真菌產生的次級代謝產物，目前人們已經發現400多種真菌毒素。毒性強的真菌毒素主要包括黃曲霉毒素B1(AflatoxinB1，AFB1)、赭曲霉毒素A(OchratoxinA，OTA)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEA)、嘔吐毒素(Deoxynivalenol，DON)、伏馬毒素(fomoni-sin，FB)、T-2毒素(T-2toxin，T-2)等。多年來，一些糧食在生長和貯存中，經常被多種不同的真菌毒素污染。即使一些真菌毒素不會同時污染同一糧食作物，但食品加工通常把多種原料加工成一種食品，造成真菌毒素的累積，人們消費這些食品時可能會同時攝入多種真菌毒素，而這些毒素可能存在毒性加和效應，對人類健康的危險系數增大。目前，實驗室常用真菌毒素檢測方法主要有四種:免疫親和柱-高效液相色譜法、酶聯免疫試劑盒Elisa方法和膠體金免疫層析方法，直接提取液相色譜質譜法。這幾種方法各有優點，但是前三種都只能測單一種類的真菌毒素，不同種類真菌毒素的分別測定成本較高，試劑損耗大且污染嚴重；第四種是直接提取樣品中的毒素用液相色譜質譜聯用同時測定多種毒素，但是為了去除檢測時樣品的基質效應，此方法需要加入全碳標記的穩定同位素毒素為內標，穩定同位素內標價格昂貴，實驗成本非常高。因此有必要開發一種實驗成本相對較低，能夠對多種真菌毒素進行同時檢測的檢驗方法，縮短分析時間，提高檢測效率，減少試劑損耗和污染，提高食品安全性。
技術實現思路
本專利技術提供了一種同時檢測多種真菌毒素的方法，解決了現有的真菌毒素檢測方法只能檢測單一毒素的缺陷，檢測成本低，提高了檢測效率，減少了試劑損耗和污染，以及以全碳標記的穩定同位素作內標，液相色譜質譜聯用同時測定多種毒素的檢測成本過高的問題。為了達到上述目的，本專利技術采用的技術方案如下：一種同時檢測多種真菌毒素的方法，其特征在于：該方法包括以下步驟：步驟一：樣品提取將25g樣品加入到100mL提取液中，振蕩離心，得到殘渣和樣品的上清液；向所述殘渣中加入體積比為800:200的甲醇和純水，振蕩離心，取殘渣的上清液；將所述樣品的上清液與所述殘渣的上清液混合為上清液；所述提取劑為按照體積比為800:10:190的乙腈、乙酸和純水混合溶液；按照體積比為10:70的比例混合所述上清液和稀釋液，然后用濾紙過濾，得到提取液；所述稀釋液為按照濃度比為0.8％:0.02％:0.02％:0.116％的NaCl、KCl、KH2PO4和Na2HPO4·12H2O的混合水溶液；步驟二：提取液凈化取所述步驟一中的提取液緩慢通過復合免疫親和柱并排干，然后用水洗滌兩次；再用體積比為2:98的乙酸和甲醇的混合液對復合免疫親和柱進行至少兩次的梯度洗脫，并收集從復合免疫親和柱流出的洗脫液；將所述洗脫液用氮氣吹干，并用50％甲醇溶液定容，得到待測液；步驟三：建立標準曲線用50％甲醇溶液配制一系列包含待檢測的多種真菌毒素組分的標準混合溶液，采用液相色譜質譜聯用同時檢測所述標準混合溶液中的真菌毒素，建立相應的標準曲線；步驟四：檢測待測液采用液相色譜質譜聯用同時檢測所述步驟二中待測液中的真菌毒素的含量，根據所述步驟三中建立的標準曲線進行定量分析；依據所述步驟三中標準溶液的質譜峰面積和濃度分別繪制每種真菌毒素的標準曲線，依據所述待測液的峰面積用外標法求出所述待測液中真菌毒素的濃度，根據所述待測液中真菌毒素的濃度計算出樣品中真菌毒素的含量。進一步，所述樣品中真菌毒素的含量的計算方法為：其中X為樣品中真菌毒素的含量，單位為μg/kg；c為提取凈化液中真菌毒素的濃度，單位為μg/L；V為加入提取液的體積，單位為mL；m為樣品質量，單位為g；f為提取液稀釋因子。進一步，所述濾紙為微纖維濾紙。進一步，所述液相色譜質譜聯用同時檢測標準混合溶液或者待測液中真菌毒素的含量的液相條件：流動相A:甲醇；流動相B：體積比為0.1％甲酸和1mmol/L乙酸銨的水溶液。進一步，所述液相色譜質譜聯用同時檢測標準混合溶液或者待測液中真菌毒素的含量的超高壓液相色譜條件：色譜柱：C18，100*2.1mm，粒徑1.6～1.8μm；柱溫40℃，進樣量為4μL，流速為0.3mL/min；進一步，所述液相色譜質譜聯用同時檢測標準混合溶液或者待測液中真菌毒素的含量的質譜條件：電噴霧離子源，多重反應監測模式。本專利技術所產生的有益效果如下：1、本專利技術提供的方法將復合免疫親和柱與液相色譜質譜聯用結合應用到同時測定糧食中多種真菌毒素的檢測領域，實驗成本相對較低，縮短分析時間，提高檢測效率，減少試劑損耗和污染，克服了現有的免疫親和柱-高效液相色譜法、酶聯免疫試劑盒Elisa方法和膠體金免疫層析真菌毒素檢測方法只能檢測單一毒素的缺陷，檢測效率低和試劑損耗大且污染嚴重的問題；以及以全碳標記的穩定同位素作內標，液相色譜質譜聯用同時測定多種毒素實驗成本昂貴的問題。2、本專利技術采用復合免疫親和柱對樣品進行凈化，去除提取液中的色素、脂類、蛋白等雜質，降低基質對毒素離子化效率的影響，用甲醇和含0.1％甲酸(體積比)和1mmol/L乙酸銨的水溶液為流動相，梯度洗脫20min內液相色譜對六種毒素能夠實現較好的分離。依據標準樣品的質譜峰面積和濃度分別繪制真菌毒素的標準曲線，以外標法對樣品進行定量。相對于現有方法具有快速、準確、檢測成本低的優勢。附圖說明圖1為本專利技術的實施例中六種真菌毒素的色譜圖。具體實施方式下面結合附圖和具體的實施方式來進一步的說明本專利技術，但本專利技術的保護范圍并不限于此。實施例1一種同時檢測多種真菌毒素的方法，利用復合免疫親和柱-液相色譜質譜聯用儀同時檢測黃曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、嘔吐毒素(DON)、伏馬毒素B1(FB1)、伏馬毒素B2(FB2)六種真菌毒素，檢測小麥中真菌毒素的方法和檢測大米中真菌毒素方法相同，以小麥為代表來詳細說明本專利技術，該檢測方法包括以下步驟：步驟一：樣品提取混合均勻的小麥粉碎至顆粒小于2mm，按照800:10:190的體積比取乙腈、乙酸和純水混合均勻，作為提取劑；同一樣品分別稱取兩份25g小麥樣品，分別加100mL提取劑；以≥10,000r/min高速均質2min或以200r/min～300r/min搖床劇烈振蕩30min；然后以4000rpm離心5min，將樣品的上清液轉移至一潔凈容器中；分別向離心后的殘渣中加入100mL體積比為800:200的甲醇和純水的混合液，以≥10,000r/min高速均質2min或以200r/min～300r/min搖床劇烈振蕩30min；然后以4000rpm離心5min，將殘渣的上清液轉移至所述潔凈容器中，合并混勻為上清液；稱取8gNaCl、0.2gKCl、0.2gKH2PO4和1.16gNa2HPO4·12H2O，加入800mL超純水溶解并定容至1L，作為稀釋液。取10mL混勻后的上清液，加入70mL稀釋液，混勻；用微纖維濾紙過濾，得到提取液。步驟二：提取液凈化采用復合免疫親和柱對提取液進行凈化，取所述步驟一中的提取液32mL上樣；調節開關，使提取液以1～2滴/秒的本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種同時檢測多種真菌毒素的方法，其特征在于：該方法包括以下步驟：步驟一：樣品提取將25g樣品加入到100mL提取劑中，振蕩離心，得到殘渣和樣品的上清液；向所述殘渣中加入體積比為800:200的甲醇和純水，振蕩離心，取殘渣的上清液；將所述樣品的上清液與所述殘渣的上清液混合為上清液；所述提取劑為按照體積比為800:10:190的乙腈、乙酸和純水混合溶液；按照體積比為10:70的比例混合所述上清液和稀釋液，然后用濾紙過濾，得到提取液；所述稀釋液為按照濃度比為0.8％:0.02％:0.02％:0.116％的NaCl、KCl、KH2PO4和Na2HPO4·12H2O的混合水溶液；步驟二：提取液凈化取所述步驟一中的提取液緩慢通過復合免疫親和柱并排干，然后用水洗滌兩次；再用體積比為2:98的乙酸和甲醇的混合液對復合免疫親和柱進行至少兩次的梯度洗脫，并收集從復合免疫親和柱流出的洗脫液；將所述洗脫液用氮氣吹干，并用50％甲醇溶液定容，得到待測液；步驟三：建立標準曲線用50％甲醇溶液配制一系列包含待檢測的多種真菌毒素組分的標準混合溶液，采用液相色譜質譜聯用同時檢測所述標準混合溶液中的真菌毒素，建立相應的標準曲線；步驟四：檢測待測液采用液相色譜質譜聯用同時檢測所述步驟二中待測液中的真菌毒素的含量，根據所述步驟三中建立的標準曲線進行定量分析；依據所述步驟三中標準溶液的質譜峰面積和濃度分別繪制每種真菌毒素的標準曲線，依據所述待測液的峰面積用外標法求出所述待測液中真菌毒素的濃度，根據所述待測液中真菌毒素的濃度計算出樣品中真菌毒素的含量。...

【技術特征摘要】
1.一種同時檢測多種真菌毒素的方法，其特征在于：該方法包括以下步驟：步驟一：樣品提取將25g樣品加入到100mL提取劑中，振蕩離心，得到殘渣和樣品的上清液；向所述殘渣中加入體積比為800:200的甲醇和純水，振蕩離心，取殘渣的上清液；將所述樣品的上清液與所述殘渣的上清液混合為上清液；所述提取劑為按照體積比為800:10:190的乙腈、乙酸和純水混合溶液；按照體積比為10:70的比例混合所述上清液和稀釋液，然后用濾紙過濾，得到提取液；所述稀釋液為按照濃度比為0.8％:0.02％:0.02％:0.116％的NaCl、KCl、KH2PO4和Na2HPO4·12H2O的混合水溶液；步驟二：提取液凈化取所述步驟一中的提取液緩慢通過復合免疫親和柱并排干，然后用水洗滌兩次；再用體積比為2:98的乙酸和甲醇的混合液對復合免疫親和柱進行至少兩次的梯度洗脫，并收集從復合免疫親和柱流出的洗脫液；將所述洗脫液用氮氣吹干，并用50％甲醇溶液定容，得到待測液；步驟三：建立標準曲線用50％甲醇溶液配制一系列包含待檢測的多種真菌毒素組分的標準混合溶液，采用液相色譜質譜聯用同時檢測所述標準混合溶液中的真菌毒素，建立相應的標準曲線；步驟四：檢測待測液采用液相色譜質譜聯用同時檢測所述步驟二中待測液中的真菌毒素的含量，根據所述步驟三中建立的標準曲線進行定量分析；依據所述步驟三中標準溶液的質譜峰面積和濃度分別繪...

【專利技術屬性】
技術研發人員：范自營，高敬銘，張紅云，高海軍，姬建生，劉瑩，秦袆芳，秦復霞，
申請(專利權)人：河南省糧油飼料產品質量監督檢驗中心，
類型：發明
國別省市：河南,41