一種應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合代謝組學(xué)方法判別真蜂蜜與糖漿摻假蜂蜜的分析方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合代謝組學(xué)方法判別真蜂蜜與糖漿摻假蜂蜜的分析方法，將真蜂蜜樣品和與真蜂蜜蜜源相同的待檢測(cè)的糖漿摻假蜂蜜樣品分別采用有機(jī)溶劑進(jìn)行前處理后，應(yīng)用超高效液相色譜?高分辨質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)對(duì)前處理后的樣品中的化學(xué)成分的分離與測(cè)定，然后對(duì)得到真蜂蜜樣品與待測(cè)蜂蜜樣品的UHPLC?MS原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，最后應(yīng)用多元統(tǒng)計(jì)分析方法PCA分析區(qū)分真蜂蜜與糖漿摻假蜂蜜。本發(fā)明專利技術(shù)的分析方法優(yōu)于其他檢測(cè)方法，不需要對(duì)某一或某些靶向物質(zhì)進(jìn)行定性定量測(cè)定，是一種宏觀非靶向的種類區(qū)分的方法。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合代謝組學(xué)方法判別真蜂蜜與糖漿摻假蜂蜜的分析方法
本專利技術(shù)涉及應(yīng)用UHPLC-QExactive聯(lián)用的代謝組學(xué)技術(shù)區(qū)分真蜂蜜與糖漿摻假蜂蜜的檢測(cè)方法，屬于食品摻假鑒別

技術(shù)介紹
蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)，蜂蜜營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，但是由于蜂蜜較高的價(jià)格和較低的產(chǎn)量，使得蜂蜜成為不法商販摻假的一個(gè)主要對(duì)象,為了提高蜂農(nóng)的生產(chǎn)積極性、保障消費(fèi)者的利益，為了支持正規(guī)蜂蜜生產(chǎn)企業(yè)的公平競(jìng)爭(zhēng)、維護(hù)蜂蜜市場(chǎng)的秩序，促進(jìn)我國(guó)蜂蜜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，因此對(duì)于找到真正蜂蜜樣品的標(biāo)志性代謝物，從而嘗試建立一套靈敏、高效、準(zhǔn)確的蜂蜜摻假鑒定方法具有非常重要的意義與價(jià)值。在真蜂蜜中摻入果葡糖漿、淀粉糖漿、大米糖漿等：這是目前最常用的蜂蜜摻假手段，由于這些糖漿的果糖和葡萄糖比例與蜂蜜中的成分非常相似，摻入后各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)完全符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，給檢測(cè)造成了很大的困難。目前常用于蜂蜜摻假進(jìn)行鑒定的方法有穩(wěn)定碳同位素比值分析法(SCIRA)、薄層色譜法(TIC)、脈沖電流檢測(cè)器的高效陰離子交換色譜法(HPAEC-PAD)、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)、高效液相同位素質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)(HPLC-IRMS)、核磁共振技術(shù)(NMR)以及近紅外光譜(NIRS)等。現(xiàn)有的方法對(duì)于測(cè)定蜂蜜摻假有許多弊端：穩(wěn)定碳同位素比值分析法(SCIRA)這種方法只對(duì)天然蜂蜜中摻入C4植物糖有效，如果蜂蜜中摻入利用水稻、小麥、大豆等C3植物淀粉制備的糖類成分或利用水稻、小麥、大豆等C3植物淀粉制備的糖類物質(zhì)與其他物質(zhì)配制的全假蜂蜜，則難以鑒別。Kushnir等利用薄層色譜法測(cè)定玉米糖漿摻假的蜂蜜確定聚合度為12到19的多聚糖為蜂蜜摻假高果糖玉米糖漿和玉米糖漿的標(biāo)志物。但是這種方法需要復(fù)雜的前處理過程來除去蜂蜜中的葡萄糖、果糖和少量寡糖，導(dǎo)致檢測(cè)方法操作復(fù)雜。脈沖電流檢測(cè)器的高效陰離子交換色譜法(HPAEC-PAD)法的局限性更大，在前期對(duì)寡糖和多聚糖的水解很可能造成假陽性結(jié)果，因?yàn)檎娣涿壑幸灿芯酆隙?-6的寡糖的存在。脈沖電流檢測(cè)器的高效陰離子交換色譜法(HPAEC-PAD)則需要復(fù)雜的前處理過程來除去單糖和寡糖，前處理過程復(fù)雜。GC-MS法測(cè)定蜂蜜摻假也有一定的缺陷，在檢測(cè)前需要對(duì)蜂蜜樣本進(jìn)行衍生化。核磁共振技術(shù)(NMR)靈敏度低，對(duì)于蜂蜜中我們所關(guān)注的代謝物可能會(huì)被忽略，并且核磁共振儀器價(jià)格昂貴，并不適用于日常監(jiān)測(cè)。近紅外光譜(NIRS)也有其致命的缺點(diǎn)：1.需要大量有代表性且化學(xué)值已知的樣品建立模型。這樣，對(duì)小批量樣品的分析用近紅外就顯得不實(shí)際了。2.模型需要不斷更新，由于儀器狀態(tài)改變或標(biāo)準(zhǔn)樣品發(fā)生變化，模型也要隨之變化了。3.模型不通用，每臺(tái)儀器的模型都不相同，增加使用的局限性。4.建模本錢高，測(cè)試用度大。現(xiàn)有的對(duì)蜂蜜品質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法如GB14963-2011以及SN/T0852-2012：對(duì)蜂蜜的感官性狀；理化指標(biāo)如：果糖葡萄糖含量，蔗糖含量等方面進(jìn)行檢測(cè)；微生物指標(biāo)，農(nóng)殘獸殘，重金屬，添加劑等方面也均進(jìn)行檢測(cè)。很多企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)則對(duì)蜂蜜中的麥芽糖、果葡萄糖漿、可可粉，檸檬酸、誘惑紅、焦糖色、山梨酸鉀、卡拉膠、食用香精等進(jìn)行測(cè)定。目前對(duì)蜂蜜摻假的各種糖漿，在理化性質(zhì)，成分組成和含量以及風(fēng)味方面與蜂蜜非常相似，因此上述對(duì)蜂蜜品質(zhì)進(jìn)行測(cè)定的方法并不能檢測(cè)出糖漿摻假的蜂蜜。綜上所述，目前現(xiàn)有技術(shù)中缺少一種對(duì)蜂蜜摻假進(jìn)行鑒定的快速有效和直觀明顯的方法，也沒有用超高效液相色譜-四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)合代謝組學(xué)法測(cè)定真正蜂蜜標(biāo)志性代謝物的有關(guān)研究。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專利技術(shù)提供一種應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合代謝組學(xué)方法判別真蜂蜜與糖漿摻假蜂蜜的分析方法，該分析方法能夠有效鑒別真蜂蜜與糖漿摻假蜂蜜。本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案如下：基于蜂蜜代謝物和糖漿代謝物的差異，本專利技術(shù)的第一個(gè)目的是提供一種應(yīng)用超高效液相色譜-四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合代謝組學(xué)方法判別真蜂蜜與糖漿摻假蜂蜜的分析方法，包括以下步驟：將真蜂蜜樣品和與真蜂蜜蜜源相同的待檢測(cè)的糖漿摻假蜂蜜樣品分別采用有機(jī)溶劑進(jìn)行前處理后，應(yīng)用超高效液相色譜-四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜方法實(shí)現(xiàn)對(duì)前處理后的樣品中的化學(xué)成分的分離與測(cè)定，然后對(duì)得到真蜂蜜樣品與待測(cè)蜂蜜樣品的UHPLC-MS原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，最后應(yīng)用多元統(tǒng)計(jì)分析方法主成分分析(PCA)模型區(qū)分真蜂蜜與糖漿摻假蜂蜜。不同蜜源蜂蜜的性質(zhì)和化學(xué)組成差別較大，根據(jù)不同的蜜源蜂蜜鑒別摻假的方法也是多種多樣。本專利技術(shù)人經(jīng)過篩選得到該應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合代謝組學(xué)方法判別真蜂蜜與糖漿摻假蜂蜜的分析方法較優(yōu)先適用于荊條蜜、洋槐蜜和棗花蜜的糖漿摻假。本專利技術(shù)的分析方法對(duì)于摻假蜂蜜所用的糖漿并沒有特別限定，涵蓋目前摻假所用的C3、C4糖漿所有種類，包括：大米糖漿、玉米糖漿、甜菜糖漿、復(fù)合果葡糖漿、網(wǎng)購(gòu)蜂蜜專用糖漿或其它糖漿。作為一種優(yōu)選方案，本專利技術(shù)中樣品前處理中采用的有機(jī)溶劑是含有甲酸的甲醇和水的混合溶劑，其中，優(yōu)選的，甲酸的體積分?jǐn)?shù)為1％，甲醇和水為等體積混合形成混合溶劑。作為一種優(yōu)選方案，本專利技術(shù)中的樣品前處理過程包括：將樣品與有機(jī)溶劑混合至樣品完全溶解，超聲，離心，過有機(jī)濾膜，得到可上機(jī)檢測(cè)的樣品。其中，超聲時(shí)間為10～30min，優(yōu)選25min；離心條件：800～1200rpm離心4～8min，優(yōu)選1000rpm離心5min；有機(jī)濾膜的孔徑為0.20～0.25μm，優(yōu)選0.22μm；為保證樣品中代謝物提取效果較好，樣品與有機(jī)溶劑的添加比例為1g：(15～25)mL。在整個(gè)前處理過程，為了保證盡可能多的獲取蜂蜜樣品以及糖漿摻假蜂蜜樣品的代謝物信息，提取試劑優(yōu)先選用的是甲醇和水的混合溶劑(含少量甲酸)對(duì)測(cè)試樣品進(jìn)行溶解，超聲后離心過有機(jī)濾膜即可上機(jī)檢測(cè)，前處理步驟簡(jiǎn)單，易于操作。色譜的分離和質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集是同時(shí)進(jìn)行的，為了使每個(gè)組分都得到分離和鑒定，必須選擇合適的色譜和質(zhì)譜分析條件。本專利技術(shù)針對(duì)蜂蜜樣品以及糖漿摻假蜂蜜組分的特點(diǎn)，考察了超高效液相色譜中的流動(dòng)相、梯度洗脫流程、柱溫和進(jìn)樣量等條件對(duì)分離效率和分析速度的影響，最終優(yōu)化篩選得到一組使得分析樣品得到最佳分離效果的超高效液相色譜條件。作為一種優(yōu)選方案，超高效液相色譜條件為：采用十八烷基鍵合硅膠柱(C18柱)；A相：乙腈，B相：醋酸銨水溶液(優(yōu)選濃度為10mM)，梯度洗脫流程：0-2min1％A，2-3.25min1％-5％A，3.25-4.25min5％A，4.25-7.75min5％-55％A，7.75-9.75min55％-90％A，9.75-11.75min90％A，11.75-12min90％-1％A，12-15min1％A。流速：0.2～0.5mL/min(優(yōu)選0.3mL/min)，柱溫30～37℃(優(yōu)選35℃)，進(jìn)樣量3微升。本專利技術(shù)針對(duì)蜂蜜樣品以及糖漿摻假蜂蜜組分的特點(diǎn)，為改善化合物的霧化和電離狀況，提高靈敏度，通過對(duì)分辨率、氣體流速、噴霧電壓等條件進(jìn)行考察，最終優(yōu)化篩選得到一組使得檢測(cè)效果準(zhǔn)確的四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜條件。作為一種優(yōu)選方案，四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜選用ThermoFisherQE本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種應(yīng)用超高效液相色譜?四極桿?軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合代謝組學(xué)方法判別真蜂蜜與糖漿摻假蜂蜜的分析方法，其特征是，包括以下步驟：將真蜂蜜樣品和與真蜂蜜蜜源相同的待檢測(cè)的糖漿摻假蜂蜜樣品分別采用有機(jī)溶劑進(jìn)行前處理后，應(yīng)用超高效液相色譜?四極桿?軌道阱高分辨質(zhì)譜方法實(shí)現(xiàn)對(duì)前處理后的樣品中的化學(xué)成分的分離與測(cè)定，然后對(duì)得到真蜂蜜樣品與待測(cè)蜂蜜樣品的UHPLC?MS原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，最后應(yīng)用多元統(tǒng)計(jì)分析方法主成分分析模型區(qū)分真蜂蜜與糖漿摻假蜂蜜。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種應(yīng)用超高效液相色譜-四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合代謝組學(xué)方法判別真蜂蜜與糖漿摻假蜂蜜的分析方法，其特征是，包括以下步驟：將真蜂蜜樣品和與真蜂蜜蜜源相同的待檢測(cè)的糖漿摻假蜂蜜樣品分別采用有機(jī)溶劑進(jìn)行前處理后，應(yīng)用超高效液相色譜-四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜方法實(shí)現(xiàn)對(duì)前處理后的樣品中的化學(xué)成分的分離與測(cè)定，然后對(duì)得到真蜂蜜樣品與待測(cè)蜂蜜樣品的UHPLC-MS原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，最后應(yīng)用多元統(tǒng)計(jì)分析方法主成分分析模型區(qū)分真蜂蜜與糖漿摻假蜂蜜。2.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征是：所述糖漿包括大米糖漿、玉米糖漿、甜菜糖漿、復(fù)合果葡糖漿、網(wǎng)購(gòu)蜂蜜專用糖漿或其它糖漿。3.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征是：樣品前處理中采用的有機(jī)溶劑是含有甲酸的甲醇和水的混合溶劑；優(yōu)選的，甲酸的體積分?jǐn)?shù)為1%，甲醇和水為等體積混合形成混合溶劑。4.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征是：樣品前處理過程包括：將樣品與有機(jī)溶劑混合至樣品完全溶解，超聲，離心，過有機(jī)濾膜，得到可上機(jī)檢測(cè)的樣品；其中，超聲時(shí)間為10~30min，優(yōu)選25min；離心條件：800~1200rpm離心4~8min，優(yōu)選1000rpm離心5min；有機(jī)濾膜的孔徑為0.20~0.25μm，優(yōu)選0.22μm；樣品與有機(jī)溶劑的添加比例為1g：（15~25）mL。5.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征是：超高效液相色譜條件為：A相：乙腈，B相：醋酸銨水溶液，梯度洗脫流程：0-2min1%A,2-3.25min1%-5%A，3.25-4.25min5%A,4.25-7.75min5%-55%A,7.75-9.75min55%-90%A,9.75-11.75min90%A,11.75-12min90%-1%A,12-15min1%A；流速：0.2~0.5mL/min，柱溫30~37℃；優(yōu)選的，所述醋酸銨水溶液的濃度為10mM，流速為0.3mL/min，柱溫35℃，進(jìn)樣量3微升。6.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征是：正譜條件為：分辨率，70000；鞘氣流速，40個(gè)單位；輔助氣流速，10個(gè)單位；反吹氣流速，0個(gè)單位；噴霧電壓，3.5kV；毛細(xì)管溫度，320℃；輔助氣溫度，350℃；掃描范圍，m/z：70-1050；掃描模式：全掃描。7.如權(quán)利...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：耿越，祝建華，江瑤，王駿，王凱利，宿書芳，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：山東師范大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：山東,37