一種登革病毒的PCR檢測(cè)方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及蚊蟲(chóng)感染登革病毒的極早期檢測(cè)方法，該方法包括針對(duì)4種登革病毒毒株保守的5’?UTR序列及基于保守序列的5’?UTR?SL?primer的設(shè)計(jì)，以此特異性5’?UTR?SL?primer的逆轉(zhuǎn)錄PCR；逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增條件的設(shè)立優(yōu)化；基于上述引物的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)和方法建立。本發(fā)明專利技術(shù)的檢測(cè)方法工藝簡(jiǎn)單高效、切實(shí)可行；設(shè)計(jì)的逆轉(zhuǎn)錄PCR引物、實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物以及擴(kuò)增條件具有高特異性、高靈敏度，可以在蚊蟲(chóng)感染登革病毒及越冬蚊蟲(chóng)蟲(chóng)卵、孑孓時(shí)期進(jìn)行極早期檢測(cè)，提供人群感染登革病毒危險(xiǎn)性評(píng)估和極早期預(yù)警。

PCR detection method for dengue virus

The present invention relates to a mosquito infected by dengue virus very early detection method, the method including the 4 dengue virus strains conserved UTR sequence and 5 'design based on the conserved sequence of the 5' UTR SL primer, the specificity of 5 \UTR SL primer RT PCR; set up optimization reverse transcription PCR amplification conditions; the establishment of the design and method of real-time fluorescence quantitative PCR primers the primers based on the. Process of detecting method of the invention is simple and efficient and feasible design; reverse transcription PCR primers, real-time PCR primers and amplification conditions with high specificity, high sensitivity, can be in mosquitoes infected with dengue virus and mosquito eggs and larvae overwintering period of very early detection of dengue virus infection, to provide risk assessment and early warning.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種登革病毒的PCR檢測(cè)方法
本專利技術(shù)屬于基因檢測(cè)
具體地，本專利技術(shù)涉及一種蚊蟲(chóng)感染登革病毒的極早期檢測(cè)方法。
技術(shù)介紹
登革熱(denguefever，DF)是由伊蚊(Aedes)傳播的、登革病毒(denguevirus,DENV)感染引起的人類最嚴(yán)重的蟲(chóng)媒傳染病，可引起登革熱(DV)、重癥登革熱和登革休克綜合征等。尤其是以高熱、嚴(yán)重出血、休克等為臨床癥狀的重癥登革熱，病死率較高。登革病毒自1943年首次被分離以來(lái)，已在100多個(gè)國(guó)家出現(xiàn)過(guò)病毒流行，全球?qū)⒔话氲娜丝?約25億)有罹患登革熱的危險(xiǎn)，世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示每年約5千萬(wàn)～1億會(huì)發(fā)生顯性感染，近3億人會(huì)發(fā)生隱性感染，顯性感染者中約50萬(wàn)人因重癥登革熱需住院治療，其中很大一部分是兒童，某些地區(qū)的死亡率約5％。由于全球氣候變暖、人口快速增長(zhǎng)、人員流動(dòng)性激增等因素，登革病毒感染的威脅正日趨嚴(yán)重，近幾十年全球登革熱發(fā)病率大幅度增長(zhǎng)。據(jù)預(yù)測(cè)，全球50-60％的人口可能會(huì)面臨威脅，登革病毒感染已成為一個(gè)世界性的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題，是世界衛(wèi)生組織呼吁全球預(yù)警和應(yīng)對(duì)(GlobalAlertandResponse，GAR)的疾病之一。在我國(guó)，登革病毒的感染也較為嚴(yán)重，廣東、廣西、海南、福建等東南沿海地區(qū)是高發(fā)地區(qū)。尤其2014年，在廣東等東南沿海地區(qū)出現(xiàn)歷史上最為嚴(yán)重的登革熱疫情，是近年來(lái)十分罕見(jiàn)的，約有3萬(wàn)多人顯性感染，發(fā)病人數(shù)是常年的10倍以上，嚴(yán)重威脅著廣東、乃至深圳廣大居民的健康。由于目前尚無(wú)特效治療手段，同時(shí)疫苗研制尚未成功，所以，在我國(guó)登革熱也是一個(gè)非常嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。登革病毒以伊蚊為傳播媒介，共有四種不同的病毒毒株。目前認(rèn)為：病毒的傳播途徑是由雌蚊叮咬帶有病毒血癥的登革熱患者或靈長(zhǎng)類，病毒在蚊蟲(chóng)體內(nèi)增殖，經(jīng)8-10天的潛伏期，再將病毒傳播給健康人，伊蚊感染后無(wú)癥狀，但可終身攜帶和傳播病毒，并可經(jīng)卵傳遞給后代。由此可見(jiàn)：伊蚊在登革病毒的自然循環(huán)中處于中心的位置。所以，針對(duì)伊蚊感染登革病毒進(jìn)行檢測(cè)將在極早期獲得疾病傳播的信息，將成為控制登革病毒在人群中傳播的極早期監(jiān)控手段。長(zhǎng)期以來(lái)，登革病毒傳播的極早期方法非常欠缺，對(duì)登革病毒的檢測(cè)常常是疫情發(fā)生之后，即出現(xiàn)人群感染病例以后的檢測(cè)，使得對(duì)登革病毒的檢測(cè)常常處于被動(dòng)和滯后的狀態(tài)，常用的檢測(cè)方法為：ELISA方法檢測(cè)病人血清中特異性的登革病毒抗體和登革病毒抗原；PCR方法檢測(cè)登革病毒的基因序列。而對(duì)于蚊蟲(chóng)感染登革病毒的檢測(cè)方法則相對(duì)欠缺，僅僅在人感染的流行區(qū)域?qū)ξ孟x(chóng)進(jìn)行登革病毒基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)基因針對(duì)登革病毒的結(jié)構(gòu)基因E基因。所以，針對(duì)蚊蟲(chóng)感染登革病毒的檢測(cè)方法尚未建立，而極早期檢測(cè)方法更是未見(jiàn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于：蚊蟲(chóng)感染登革病毒的極早期檢測(cè)技術(shù)。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本專利技術(shù)的技術(shù)方案為提供一種登革病毒的PCR檢測(cè)方法，包括如下步驟：S1、登革病毒RNA的提取純化：勻漿破碎蚊蟲(chóng)蟲(chóng)體和/或孑孓蟲(chóng)體和/或蟲(chóng)卵，提取全部RNA分子，采取負(fù)向選擇的方法去除宿主mRNA，純化得到登革病毒RNA；S2、登革病毒RNA分子的逆轉(zhuǎn)錄：根據(jù)登革病毒不同毒株之間的共有序列，設(shè)計(jì)特異性逆轉(zhuǎn)錄PCR的莖環(huán)狀引物，逆轉(zhuǎn)錄所述登革病毒RNA得到登革病毒的cDNA；S3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR：根據(jù)所述共有序列和所述莖環(huán)狀引物，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法定量檢測(cè)登革病毒的濃度。在本專利技術(shù)提供的登革病毒的PCR檢測(cè)方法中，所述步驟S1中，基于蚊蟲(chóng)mRNA具有3’-polyA、而登革病毒RNA的3’末端沒(méi)有多聚polyA的特征，利用寡dT纖維素-核酸純化柱吸附除去宿主mRNA分子，保留沒(méi)有3’-polyA的RNA，利用負(fù)向選擇純化登革病毒RNA。在本專利技術(shù)提供的登革病毒的PCR檢測(cè)方法中，所述步驟S2中，所述共有序列為5’-ttttwawtagagagcagatctctg-3’，其中w為a或t；所述莖環(huán)狀引物為：5’-CAGAGATCTGCTCTTAWTWAAAAGTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTTTTWAW-3’。在本專利技術(shù)提供的登革病毒的PCR檢測(cè)方法中，針對(duì)登革病毒不同毒株基因組中5’-UTR的特征性一致序列，采用簡(jiǎn)并密碼獲得所述共有序列。在本專利技術(shù)提供的登革病毒的PCR檢測(cè)方法中，所述步驟S3中，設(shè)計(jì)一對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，引物序列如下：正向引物：5’-ttttawwtagagagcagatctctg-3’反向引物：5’-GTCACGCACAGCACCTCA-3’以所述登革病毒的cDNA為模板，使用所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物定量檢測(cè)登革病毒的濃度。實(shí)施本專利技術(shù)，具有如下有益效果：本專利技術(shù)的檢測(cè)方法工藝簡(jiǎn)單高效、切實(shí)可行；設(shè)計(jì)的逆轉(zhuǎn)錄PCR引物、實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物以及擴(kuò)增條件具有高特異性、高靈敏度，可以在蚊蟲(chóng)感染登革病毒及越冬蚊蟲(chóng)蟲(chóng)卵、孑孓時(shí)期進(jìn)行極早期檢測(cè)，提供人群感染登革病毒危險(xiǎn)性評(píng)估和極早期預(yù)警。附圖說(shuō)明為了更清楚地說(shuō)明本專利技術(shù)實(shí)施例的技術(shù)方案，對(duì)實(shí)施例描述中所使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。附圖中：圖1為登革病毒四種毒株對(duì)比及共有序列；圖2為逆轉(zhuǎn)錄PCR的特異性莖環(huán)狀引物5’-UTRSLprimer。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合附圖對(duì)本專利技術(shù)的實(shí)施例進(jìn)行具體描述。本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問(wèn)題在于蚊蟲(chóng)感染登革病毒的極早期檢測(cè)技術(shù)：目前常用的檢測(cè)方法是在疫情發(fā)生之后利用ELISA技術(shù)檢測(cè)病人血清中特異性的登革病毒抗體、登革病毒抗原和PCR方法檢測(cè)登革病毒的基因序列。而對(duì)于蚊蟲(chóng)感染登革病毒的檢測(cè)方法則相對(duì)欠缺，僅僅在人感染登革病毒的流行疫區(qū)對(duì)蚊蟲(chóng)中登革病毒結(jié)構(gòu)基因E基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，特異性、靈敏度均不理想。而且上述方法具有明顯的滯后性，檢測(cè)的對(duì)象均為疫情發(fā)生后的人群和蚊蟲(chóng)群體，無(wú)法在疫情發(fā)生極早期、蚊蟲(chóng)感染時(shí)期進(jìn)行監(jiān)控，而蚊蟲(chóng)感染登革病毒是登革熱疫情發(fā)生的源頭事件。所以，針對(duì)蚊蟲(chóng)感染登革病毒的極早期檢測(cè)方法的建立將在疫情發(fā)生的源頭提出預(yù)警，可以有效避免人群的大規(guī)模感染，控制疫情的發(fā)生發(fā)展。在蚊蟲(chóng)感染登革病毒的極早期，病毒的滴度非常低，需要靈敏度高、特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法。目前常用的檢測(cè)方法是針對(duì)蚊蟲(chóng)感染登革病毒后，登革病毒結(jié)構(gòu)基因E基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，該方法的靈敏度不高，且特異性不強(qiáng)，也無(wú)法確保四種登革病毒毒株均被有效檢出。本專利技術(shù)要解決的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題是在蚊蟲(chóng)感染登革病毒的極早期，即病毒滴度很低的情況下，建立靈敏度高、特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法。本專利技術(shù)是通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)：針對(duì)4種登革病毒毒株保守的5’UTR序列及基于保守序列的5’-UTRSLprimer的設(shè)計(jì)，5’-UTR即5’-非翻譯區(qū)(5’-untranslatedregions)，以此特異性5′-UTRSLprimer進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR，并對(duì)逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增條件的設(shè)立優(yōu)化，獲得4種病毒毒株特異性cDNA片段；基于上述特異性引物的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)，并以登革病毒特異性cDNA片段為模板，建立靈敏度高、特異性強(qiáng)的熒光定量PCR方法為登革病毒極早期檢測(cè)方法。本專利技術(shù)的檢測(cè)方法中設(shè)計(jì)的逆轉(zhuǎn)錄PCR引物和實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物以及擴(kuò)增條件具有高度特異性和靈敏度本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種登革病毒的PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟：S1、登革病毒RNA的提取純化：勻漿破碎蚊蟲(chóng)蟲(chóng)體和/或孑孓蟲(chóng)體和/或蟲(chóng)卵，提取全部RNA分子，采取負(fù)向選擇的方法去除宿主mRNA，純化得到登革病毒RNA；S2、登革病毒RNA分子的逆轉(zhuǎn)錄：根據(jù)登革病毒不同毒株之間的共有序列，設(shè)計(jì)特異性逆轉(zhuǎn)錄PCR的莖環(huán)狀引物，逆轉(zhuǎn)錄所述登革病毒RNA得到登革病毒的cDNA；S3、實(shí)時(shí)熒光PCR：根據(jù)所述共有序列和所述莖環(huán)狀引物，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，利用實(shí)時(shí)熒光PCR的方法定量檢測(cè)登革病毒的濃度。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種登革病毒的PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟：S1、登革病毒RNA的提取純化：勻漿破碎蚊蟲(chóng)蟲(chóng)體和/或孑孓蟲(chóng)體和/或蟲(chóng)卵，提取全部RNA分子，采取負(fù)向選擇的方法去除宿主mRNA，純化得到登革病毒RNA；S2、登革病毒RNA分子的逆轉(zhuǎn)錄：根據(jù)登革病毒不同毒株之間的共有序列，設(shè)計(jì)特異性逆轉(zhuǎn)錄PCR的莖環(huán)狀引物，逆轉(zhuǎn)錄所述登革病毒RNA得到登革病毒的cDNA；S3、實(shí)時(shí)熒光PCR：根據(jù)所述共有序列和所述莖環(huán)狀引物，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，利用實(shí)時(shí)熒光PCR的方法定量檢測(cè)登革病毒的濃度。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的登革病毒的PCR檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟S1中，基于蚊蟲(chóng)mRNA具有3’-polyA、而登革病毒RNA的3’末端沒(méi)有多聚polyA的特征，利用寡dT纖維素-核酸純化柱吸附除去宿主mRNA分子，保留沒(méi)有3’-polyA的RNA，利用負(fù)向選擇純化登革病毒RNA。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的登革...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李凌云，王曉紅，蘇慶寧，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：深圳大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：廣東,44