一種高效溶磷菌及其應用制造技術

一種高效溶磷菌及其應用，屬于生物工程【技術領域】。本發明專利技術提供了一種泛菌Pantoea?sp.，命名為DDC?95，可作為溶磷菌輔助植物生長。該菌株分離自大豆根際，對促進大豆對土壤中難溶的無機磷素吸收利用效果明顯，具有廣闊的應用前景和市場價值。

【技術實現步驟摘要】
一種高效溶磷菌及其應用
本專利技術屬于生物工程
，涉及一種高效溶磷菌及其應用。
技術介紹
磷是作物營養三要素之一，我國大部分土地磷元素缺乏，土壤中的磷一般不能滿足作物生長發育的需要，必須通過施磷肥來補充。但是，磷肥容易被土壤固定，并在土壤中累積，其主要原因是磷肥中的磷酸根離子與土壤中的鈣鎂等陽離子結合形成難溶性磷酸鹽。因此，長期大量施用磷肥會導致土壤中緩效磷的富集，造成土壤板結。此外，由于磷肥在土壤中移動性小，肥效轉化慢，如果施用方式方法不得當，作物將難以及時吸收利用。目前我國的磷肥利用率僅為10%-25%。有數據顯示,我國自從上個世紀50年代使用磷肥以來，土壤中累積的難溶性磷已高達6000萬噸，超過目前全國磷肥10年消費量的總和。這一現狀不僅代表了資源的巨大浪費，同時也會引起一系列的環境問題。因此從自然界中篩選高效溶解無機磷的細菌能夠有效開發和利用土壤中被固定的磷，提高土壤磷的有效性，減少磷肥的施用量。 但是現有溶磷菌普遍存在在田間應用效果不顯著的問題，其主要原因是目前的研究缺乏針對某一作物種類進行與其相匹配的溶磷菌株的篩選工作。大豆是重要的糧食及油料作物，目前我國大豆生產普遍施用化肥(包括磷肥)，但是與發達國家相比單產較低，針對這一現狀，篩選出適宜大豆專用的溶磷菌菌株，提高大豆對土壤中磷素的利用率，從而減少磷肥的施用量，對于發展我國的大豆產業以及減少環境污染和能源浪費具有重要的戰略意義。
技術實現思路
本專利技術所解決的技術問題是提供了一種高效溶磷菌。所述高效溶磷菌保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCCN0.6302，經16SrDNA序列測定及NCBI數據庫在線比對，鑒定為泛菌Pantoea sp.，該菌株可輔助植物生長；所述菌株16SrDNA如SEQ ID N0.1所示。具體而言，是在土壤中添加0.l_5%Ca3(P04)2，其中優選0.5_2%Ca3 (PO4) 2，采用土壤盆栽試驗，種植大豆品種黑河48，于初花期收集大豆根際土壤，通過無機磷培養基篩選出一株具有較強溶解無機磷功能的促生菌DDC 95。所述黑河48為國審通過的早熟大豆品種，由黑龍江省農業科學院黑河分院選育，該品種適宜在黑龍江省第三積溫帶下限和第四積溫帶春播種植。該菌株分離方法為平板篩選法，將大豆根際土壤制成土壤懸液，稀釋成KT1-KT7濃度梯度，取100μ I KT5-1O-7稀釋度的土壤懸液涂于解無機磷培養基平板上，28°c培養4-5天后，觀察菌落周圍有無溶磷圈產生，并測量菌落及溶磷圈直徑。IL無機磷培養基的成分為:(NH4)2SO40.5g，MgSO4.7H20 0.3g，Ca3(PO4)2IOg, NaCl 0.3g，葡萄糖 10g，MnSO4 (1%)ImL, FeSO4 (1%) ImL,瓊脂 20g。從平板中挑選具有較強溶解無機磷能力的菌株，富集培養后，稀釋菌體并涂布于無機磷培養基平板上，其中Ca3(PO4)2為2%，觀察菌落周圍有無溶磷圈產生，并測量菌落及溶磷圈直徑，從中篩選具有較強溶解無機磷能力的菌株。重復上述步驟直至Ca3(PO4)2濃度達到5%，最終篩選得到一株具有較強溶解無機磷能力的菌株，對該菌株進行16SrDNA測定，序列如SEQ ID N0.1所示，鑒定該菌株為泛菌Pantoeasp.0上述菌株命名為DDC 95，已于2012年6月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.6302，建議分類命名為泛菌Pantoea sp.地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，部分16SrDNA序列如SEQIDN0.1 所示。該菌為革蘭氏陰性，顯微鏡下觀察菌體呈桿狀，菌體平均長度3_4μπι，平均寬度0.4-0.5 μ m, DDC 95在解無機磷固體培養基和牛肉膏蛋白胨固體培養基上均生長良好，28°C培養4-5天，菌落直徑可達3-4mm，菌落呈圓形，邊緣整齊，顏色呈乳黃色，表面較干，菌落中心呈扁平圓形突起，略高于菌落邊緣。該菌株在添加5%Ca3 (PO4) 2培養基上培養5天，菌落直徑為0.3~0.5cm,溶磷圈直徑為0.54~2.10cm，溶磷比為1.8~4.2。為進一步確定菌株的溶解無機磷的能力，通過鑰銻抗比色法測定菌液的溶磷量。首先將一環菌體接種于5mL解無機磷液體培養基中，28°C振蕩培養7天。通過鑰銻抗顯色法制做含磷量分別為0.0、0.3,0.6,0.9,1.2,1.5、1.8mg/L標準磷溶液系列，通過紫外分光光度計測定OD72tl的吸光度，繪制磷標準曲線，得到的二元一次方程為:Y=0.056IX-0.0527，R2=0.9995。將培養好的菌液超聲波破碎細胞20min, 4000rpm離心20min，取上清3mL，加2滴2，6- 二硝基酚作指示劑，加I滴50mL/L硫酸調節pH值，加5mL鑰銻抗顯色劑，定容到50mL，室溫下顯色30min。同時以不接菌的解無機磷液體培養基為空白對照，同樣方法制備顯色。由于測定的吸光度大于0.676，超出了測定范圍，因此將樣品稀釋10倍，再次測定吸光度在磷標準曲線所對應的吸光值范圍之內，將結果代入方程，乘以相應的稀釋倍數，并扣除空白對照中有效磷的含量，最終求得菌液的溶磷量為936.19mg/L。為了獲得菌株的最佳生長條件，通過正交實驗得到了優化培養基為麥芽糖6g/L、尿素 0.04g/L、NaCl 4g/L、pH 6，在 28。C 下培養 48h 菌落總數可達 7.23X 109CFU/mL。本專利技術還提供了所述菌株在土壤治理中的應用，將CGMCC N0.6302發酵液以0.1%-10%的比例投放于添加0.1%_5%磷酸三鈣的土壤中。優選方法是:是將發酵液以1%的比例投放于添加1%磷酸三鈣的土壤中，定期澆水，保持土壤濕潤，經過20天后，測定土壤中有效磷的含量從不接菌時的57.78mg/kg，增加到 383.89mg/kg。本專利技術具有如下優點:該菌株為革蘭氏陰性細菌，培養條件及方法簡便易行。菌株溶磷量非常高，該菌株分離自大豆根際，對促進大豆對土壤中難溶的無機磷素吸收利用效果明顯。具有廣闊的應用前景和市場價值?！緦＠綀D】【附圖說明】圖1DDC 95在解無機磷培養基上的溶磷圈圖2革蘭氏染色后在100倍油鏡下觀察DDC 95菌體情況【具體實施方式】實施例1在土壤中添加l%Ca3(P04)2，采用土壤盆栽試驗，種植大豆品種黑河48，于初花期收集大豆根際土壤，將大豆根際土壤制成土壤懸液，稀釋成KT1-KT7濃度梯度，取100 μ 110_5-10_7稀釋度的土壤懸液涂于無機磷培養基平板上，28 0C培養4-5天后，觀察菌落周圍有無溶磷圈產生，并測量菌落及溶磷圈直徑。IL解無機磷培養基的成分為:(NH4)2SO40.5g, MgS04.7Η200.3g, Ca3 (PO4)2IOg, NaCl 0.3g，葡萄糖 IOg, MnSO4 (1%) ImL,FeSO4 (1%) lmL，瓊脂 20g。從平板中挑選具有較強溶解無機磷能力的菌株，富集培養后，稀釋菌體并涂布于無機磷培養基平板上，其中Ca3(PO4)2為2%，觀察菌落周圍有無溶磷圈產生，并測量菌落及溶磷圈直徑，從中篩選具有較強本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
1.一種高效溶磷菌，其特征在于，所述菌株保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC N0.6302。2.根據權利要求1所述溶磷菌，其特征在于，所述菌株總DNA經引物799F，1492R擴增后獲得16SrDNA序列如SEQ ID N0.1所示。3.根據權利要求1所述溶磷菌，其特征在于，所述菌株為革蘭氏陰性，顯微鏡下觀察菌體呈桿狀，菌體平均長度3-4 μ m,平均寬度0.4-0.5 μ m,在解無機磷固體培養基和牛肉膏蛋白胨固體培養基上均生長良好，28°C培養4-5天，菌落直徑可達3-4mm，菌落呈圓形，邊緣整齊，顏色呈乳黃色，表面較干，菌落中心呈扁平圓形突起，略高于菌落邊緣。4.一種權利要求1所述溶磷菌的應用方法，其特征在于，將CGMCC N0.6302發酵液以0.1%-...

【專利技術屬性】
技術研發人員：王浩，王紹東，李遠明，姜研，劉偉，李宏偉，
申請(專利權)人：黑龍江省大豆技術開發研究中心，
類型：發明
國別省市：