本發明專利技術涉及一種從油菜葉中提取高純度SOD（超氧化物歧化酶）的方法。取新鮮的油菜葉1重量份，加入2-3重量份的磷酸鉀緩沖液中，勻漿、離心獲得葉綠體；再將葉綠體放入磷酸鉀緩沖液中，結合超聲波處理，離心獲得粗酶液；加硫酸銨沉淀獲得粗SOD，凈離子交換柱分離、濃縮、冷凍干燥獲得高純度的SOD制品。該方法生產SOD具有純度高、成本低、易推廣應用等優點。
【技術實現步驟摘要】
—種從油菜葉中提取高純度SOD的方法
本專利技術提供一種從油菜葉中提取高純度SOD的方法，屬于食品深加工的領域。
技術介紹
超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase),簡稱S0D,是一種新型酶制劑,屬金屬酶.它是一種源于生命體的活性物質，SOD是機體內危害最大的氧自由基專一清除劑，亦是其他自由基最有效的清除劑，它與體內的谷胱甘肽過氧酶、過氧化氫酶聯手，把自由基轉化為水和氧分子。能消除生物體在新陳代謝過程中產生的有害物質。對人體不斷地補充SOD具有抗衰老的特殊效果。從植物，特別是人們日常經常食用的蔬菜、瓜果、野生植物及糧食中提取S0D，使用安全性非常高，避免了可能發生的交叉感染。利用全新的生物技術從植物中提取S0D，具有明顯的社會和經濟效益，市場前景廣闊。從植物中提取SOD的主要傳統工藝流程為:植物—打漿一超濾分離一有機溶劑去雜一柱層析精制一超濾濃縮一冷凍干燥一產品。
技術實現思路
: 本專利技術提供一種從油菜葉中提取高純度SOD的方法，該方法采用獨有的磷酸鉀緩沖液配方:50mmol/L的磷酸鉀緩沖液，除含有磷酸鉀外，還含有lmmol/L的EDTA、0.4mmol/L的蔗糖、0.01%巰基乙醇，且緩沖液的pH值為7.9 ；5mmol/L的磷酸鉀緩沖液，除含有磷酸鉀外，還含有lmmol/L的巰基乙醇，且緩沖液的pH值為7.9 ;并且優化了離子交換柱和凝膠柱分離的條件；通過該法可以獲得純度更高、成本更低的S0D。本專利技術的技術方案: A、取新鮮的油菜葉I重量份，加入2-3重量份50mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，攪打勻漿，用100-120目篩抽濾，將濾液以30`00-5000轉/分鐘，離心16-25分鐘獲得葉綠體； B、將A步驟所得葉綠體用0.2-0.3重量份50mmol/L的磷酸鉀緩沖液沖洗兩次；放入5mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，一邊攪拌一邊用超聲波進行粉碎處理，經離心機4000-6000轉/分鐘，離心20-30分鐘，獲得上清液即為粗酶液； C、向B步驟所得粗酶液中加入硫酸銨，直至硫酸銨的飽和度達到50-60%，靜置2-4小時，經離心機4000-6000轉/分鐘，離心30-40分鐘，取上清液； D、向C步驟所得上清液中加入硫酸銨至飽和濃度為93-97%，靜置2-4小時，經離心機4000-6000轉/分鐘，離心40-50分鐘，所得沉淀物即為粗制的SOD ； Ejf D步驟所得的粗制S0D，加入3-5倍體積的5mmol/L的磷酸鉀緩沖液溶解并透析，將透析過的溶液通過低溫真空濃縮至原體積的1/3-1/4 ； F、將E步驟所得濃縮液經SephadexG-75凝膠柱或DEAE- Sephadex A-50離子交換柱進行提純；凝膠柱的洗脫液為5mmol/L的磷酸鉀緩沖液溶；離子交換柱的洗脫液為5-300mmol/L的磷酸鉀緩沖液溶，進行梯度洗脫； G、將F步驟所得洗脫液經低溫真空濃縮，然后冷凍干燥后即可獲得高純度的油菜葉綠體 S0D。其中，50mmol/L的磷酸鉀緩沖液，除含有磷酸鉀外，還含有lmmol/L的EDTA、0.4mmol/L的蔗糖、0.01%巰基乙醇，且緩沖液的pH值為7.9 ；5mmol/L的磷酸鉀緩沖液，除含有磷酸鉀外，還含有lmmol/L的巰基乙醇，且緩沖液的pH值為7.9。本專利技術解決的技術問題: 1、采用了新的工藝流程，比傳統工藝步驟少，設備簡單，節約了成本，易于推廣。2、采用了獨有的磷酸鉀緩沖液配方，在提高了分離效率的同時對SOD的活性進行了很好的保護，保證了成品的質量。3、對不同類型的柱子采用新的洗脫條件，提高了產品的活性和純度，本專利技術可以將產品提純150倍，傳統工藝在100倍左右，而活性比傳統工藝提高了 10倍。【具體實施方式】實施例1: A、取新鮮的油菜葉100公斤,加入200公斤50mmol/L的磷酸鉀緩沖液中,攪打勻衆,用100目篩抽濾，將濾液以3000轉/分鐘，離心25分鐘獲得葉綠體； B、將A步驟所得葉綠體用20公斤50mmol/L的磷酸鉀緩沖液沖洗兩次；放入5mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，一邊攪拌一邊用超聲波進行粉碎處理，經離心機4000轉/分鐘，離心30分鐘，獲得上清液即為粗酶 液； C、向B步驟所得粗酶液中加入硫酸銨，直至硫酸銨的飽和度達到50%，靜置2小時，經離心機4000轉/分鐘，離心40分鐘，取上清液； D、向C步驟所得上清液中加入硫酸銨至飽和濃度為93%，靜置2小時，經離心機4000轉/分鐘，離心40分鐘，所得沉淀物即為粗制的SOD ； Ejf D步驟所得的粗制SODjaA 3倍體積的5mmol/L的磷酸鉀緩沖液溶解并透析，將透析過的溶液通過低溫真空濃縮至原體積的1/3 ； F、將E步驟所得濃縮液經SephadexG-75凝膠柱，洗脫液為5mmol/L的磷酸鉀緩沖液溶，進行洗脫； G、將F步驟所得洗脫液經低溫真空濃縮，然后冷凍干燥后即可獲得高純度的油菜葉綠體 S0D。所得SOD的活性為:1156.3U/mg，提純倍數為:142.22倍。實施例2: A、取新鮮的油菜葉100公斤,加入300公斤50mmol/L的磷酸鉀緩沖液中,攪打勻衆,用110目篩抽濾，將濾液以5000轉/分鐘,離心16分鐘獲得葉綠體； B、將A步驟所得葉綠體用30公斤50mmol/L的磷酸鉀緩沖液沖洗兩次；放入5mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，一邊攪拌一邊用超聲波進行粉碎處理，經離心機6000轉/分鐘，離心20分鐘，獲得上清液即為粗酶液； C、向B步驟所得粗酶液中加入硫酸銨，直至硫酸銨的飽和度達到60%，靜置4小時，經離心機6000轉/分鐘，離心50分鐘，取上清液； D、向C步驟所得上清液中加入硫酸銨至飽和濃度為97%，靜置4小時，經離心機6000轉/分鐘，離心50分鐘，所得沉淀物即為粗制的SOD ； Ejf D步驟所得的粗制SODjaA 5倍體積的5mmol/L的磷酸鉀緩沖液溶解并透析，將透析過的溶液通過低溫真空濃縮至原體積的1/4 ； F、將E步驟所得濃縮液經SephadexG-75凝膠柱，洗脫液為5mmol/L的磷酸鉀緩沖液溶，進行洗脫； G、將F步驟所得洗脫液經低溫真空濃縮，然后冷凍干燥后即可獲得高純度的油菜葉綠體 SOD。所得SOD的活性為:1048.3U/mg，提純倍數為:148.13倍。實施例3: A、取新鮮的油菜葉100公斤,加入250公斤50mmol/L的磷酸鉀緩沖液中,攪打勻衆,用100目篩抽濾,將濾液以4500轉/分鐘,離心20分鐘獲得葉綠體； B、將A步驟所得葉綠體用25公斤50mmol/L的磷酸鉀緩沖液沖洗兩次；放入5mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，一邊攪拌一邊用超聲波進行粉碎處理，經離心機5000轉/分鐘，離心25分鐘，獲得上清液即為粗酶液； C、向B步驟所得粗酶液中加入硫酸銨，直至硫酸銨的飽和度達到55%，靜置3小時，經離心機5000轉/分鐘，離心45分鐘，取上清液； D、向C步驟所得上清液中加入硫酸銨至飽和濃度為95%，靜置3小時，經離心機5000轉/分鐘，離心45分鐘，所得沉淀物即為粗制的SOD ； Ejf D步驟所得的粗制SODjaA 4倍體積的5mmol/L的磷酸鉀緩沖液溶解并透析，將本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
1.一種從油菜葉中提取高純度SOD的方法，其特征在于，該方法通過以下工藝步驟: A、取新鮮的油菜葉I重量份，加入2-3重量份50mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，攪打勻漿，用100-120目篩抽濾，將濾液以3000-5000轉/分鐘，離心16-25分鐘獲得葉綠體； B、將A步驟所得葉綠體用0.2-0.3重量份50mmol/L的磷酸鉀緩沖液沖洗兩次；放入5mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，一邊攪拌一邊用超聲波進行粉碎處理，經離心機4000-6000轉/分鐘，離心20-30分鐘，獲得上清液即為粗酶液； C、向B步驟所得粗酶液中加入硫酸銨，直至硫酸銨的飽和度達到50-60%，靜置2-4小時，經離心機4000-6000轉/分鐘，離心30-40分鐘，取上清液； D、向C步驟所得上清液中加入硫酸銨至飽和濃度為93-97%，靜置2-4小時，經離心機4000-6000轉/分鐘，離心40-50分鐘，所得沉淀物即為粗制的SOD ； Ejf D步驟所得的粗制S0D，...
【專利技術屬性】
技術研發人員：畢玉軒，
申請(專利權)人：青島百草匯中草藥研究所，
類型：發明
國別省市：
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