一株可高效降解殺菌劑百菌清的降解菌及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一株可高效降解殺菌劑百菌清的降解菌，該降解菌的分類命名為：蒼白桿菌（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ　ｌｕｐｉｎｉ），于２００７年６月２８日保藏于《中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心》，其保藏號(hào)為ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．２０９８。用途為：該菌株用于降解殺菌劑百菌清，可用于受百菌清污染的水體、土壤或農(nóng)產(chǎn)品的生物凈化。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物
，更確切地說，涉及一株可高效降解殺菌劑百菌清的降解菌及 其用途
技術(shù)介紹
百菌清作為農(nóng)業(yè)用殺菌劑，主要用于防治各種真菌病害，據(jù)美國USGS (United States Geological Survey)統(tǒng)計(jì)，百菌清近年在美國的年使用量超過4. 8X 106公斤。我國百菌清的 年生產(chǎn)能力已突破8000噸。雖然百菌清的主要應(yīng)用對象是作物的葉部病害，但當(dāng)作物冠層較 薄和過量施用時(shí)，其大部分進(jìn)入土壤并造成嚴(yán)重的污染(Cisar and Snyder, 1996; Petrovic etal., 1996)。有證據(jù)表明，百菌清可以遠(yuǎn)距離遷移，己在北極圈內(nèi)監(jiān)測到了百菌清的存在 (Chernyak et al. ， 1996)。百菌清具有明顯的蓄積毒性，可致動(dòng)植物發(fā)生遺傳性突變，能 誘發(fā)小鼠骨髓淋巴細(xì)胞姊妹染色單體交換率(SCE)的增加。同時(shí)也是環(huán)境激素類似物，對人和 動(dòng)物內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生干擾作用，影響人和動(dòng)物的生殖繁衍，造成雌性化、腺體病變和后代生 命力退化等，而成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。因此研究其微生物降解具有重要的意義。減少農(nóng)藥的使用以及去除農(nóng)藥殘留是減輕農(nóng)藥危害的有效途徑。有機(jī)氯殺菌劑的消除方 法有很多，包括物理、化學(xué)和生物方法。同物理化學(xué)方法相比，生物修復(fù)具有可基本保持土 壤的理化特性，污染物降解完全、處理成本低和應(yīng)用廣泛的特點(diǎn)。農(nóng)藥殘留微生物降解技術(shù) 是通過在土壤中接種高效降解性微生物，原位消除土壤中的農(nóng)藥殘留，降低土壤中農(nóng)藥污染 物的含量，從而減少進(jìn)入作物體內(nèi)的農(nóng)藥。本技術(shù)投入低、效率高，己經(jīng)在無公害農(nóng)產(chǎn)品生 產(chǎn)中得到應(yīng)用，是一項(xiàng)已經(jīng)獲得農(nóng)民認(rèn)可的、可操作性強(qiáng)的無公害農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)技術(shù)。應(yīng)用微 生物或無細(xì)胞制品來削減農(nóng)藥污染的生物修復(fù)技術(shù)顯示出廣闊的應(yīng)用前景。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一株可高效降解殺菌劑百菌清的降解菌，該降解菌從河南省受百菌 清嚴(yán)重污染的土壤中分離獲得，能夠以百菌清為唯一碳源，具有高效降解百菌清的能力。本專利技術(shù)的另一目的是提供本專利技術(shù)的可高效降解殺菌劑百菌清的降解菌的用途，其用途是 降解殺菌劑百菌清。本專利技術(shù)的技術(shù)方案如下本專利技術(shù)提供的一株可高效降解百菌清的降解菌，其特征在于，該降解菌的分類命名為蒼白桿菌(Oc/ ra^"n/m于2007年6月28日保藏于《中國微生物菌種保藏管理委員 會(huì)普通微生物中心》，其保藏號(hào)為CGMCC No. 2098。 該降解菌(TP-D1)經(jīng)形態(tài)、生理生化特性分析和16S rRNA基因序列同源性分析，鑒定 為蒼白桿菌屬中的OcZ/ra6a"n^ /w; /m'， TP-D1株在pH7.0至8.0、溫度30至35。C生長良好， 能以百菌清為唯一碳源生長。采用氣相色譜法測定菌株TP-D1對百菌清的降解率，3(TC培養(yǎng)4天對對百菌清的降解率 達(dá)到90.4%。采用液相色譜法測定菌株TP-D1對土壤中百菌清的降解率，結(jié)果表明TP-Dl與 百菌清在土壤中室溫共培養(yǎng)l周，百菌清的殘留可降低99.7%。采用薄板層析(TLC)、高壓 液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MC)技術(shù)分析了菌株TP-D1降解百菌清的中間產(chǎn)物。結(jié)果表明，主 要代謝中間產(chǎn)物是4-羥基-三氯苯二腈(TPN-0H)和1,3-二酰胺-四氯苯，其中1,3-二酰胺-四氯苯為新發(fā)現(xiàn)的純培養(yǎng)微生物降解百菌清的中間產(chǎn)物。本專利技術(shù)的可高效降解殺菌劑百菌清的降解菌的篩選采集河南省受百菌清嚴(yán)重污染的土壤，取污染土樣1. 0g加入到含有50mg/L百菌清的牛 肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，28°C， 180轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)4天，然后以5% (V/V)的接種量轉(zhuǎn)接到較 高濃度的含藥培養(yǎng)液中，百菌清的加藥濃度依次為50mg/L、 100mg/L、 150tng/L、依次類推， 至600mg/L，即可得到不同濃度的富集培養(yǎng)液。取0. lmL富集液涂布到相應(yīng)含藥濃度的平板 上，28°C，培養(yǎng)48小時(shí)。發(fā)現(xiàn)了一株生長速度最快而且菌落周圍出現(xiàn)透明圈的菌株。將該菌 株接種到含有50mg/L百菌清的無機(jī)鹽培養(yǎng)基上，菌落周圍可出現(xiàn)清晰的透明圈，將該菌株定 名為TP-Dl。認(rèn)為該菌株可利用百菌清為唯一碳源，不同于前人的研究報(bào)道，是一株很有潛 力的降解菌。氣相色譜法測定了在無機(jī)鹽培養(yǎng)液中該菌株對百菌清的降解能力，培養(yǎng)液中菌 體的含量為每毫升培養(yǎng)液中107個(gè)，百菌清的濃度為50mg/L，于3(TC、 180轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)4 天，百菌清的降解率為90.4%。應(yīng)用所分離到的蒼白桿菌TP-Dl經(jīng)發(fā)酵后將該菌的發(fā)酵液處 理添加了 50mg/L百菌清的無菌土， 土壤中菌體含量為每克土壤107個(gè)菌體，室溫共培養(yǎng)1周， 液相色譜法測定百菌清的殘留可降低99. 7%。所述的富集培養(yǎng)基的組分及配比為牛肉膏3.0g，蛋白胨5.0g，瓊脂18.0g，葡萄糖IO.O g，酵母浸膏1.0g， H2O 1000mL，調(diào)pH值至7.0， 121。C高壓滅菌30min。所述的無機(jī)鹽培養(yǎng)基的組分及配比為NH4N03 l.Og， MgS04'7H20 0.5g， (NH4)2S04 0.5g， KH2PO40.5g， NaCI0.5g， K2HP04 1.5g， H20 lOOOmL，用lmol/LHCl或NaOH調(diào)節(jié)pH值至 7.0， 121。C高壓滅菌30min。該菌株的特征在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上形成菌落為乳白色、圓形、邊緣整齊，濕潤， 表面凸起、直徑2.0mm左右；革蘭氏陰性，菌體桿狀，大小約為1.6x0.75nm，極生鞭毛，氧 化酶、過氧化氫酶陽性。甲基紅試驗(yàn)和V-P試驗(yàn)均為陰性。精氨酸、尿氨酸、賴氨酸水解陽 性，枸櫞酸鹽、尿素、蔗糖、麥芽糖、木糖、乳糖發(fā)酵陽性。七葉靈、靛基質(zhì)、硝酸鹽還原、硫化氫、ONPG測定為陰性。能利用山梨醇、果糖、木糖、甘露醇、肌醇作為其碳源，不能利用乳糖、甘露糖、麥芽糖、甘油。測定了該菌株的16S rDNA序列，測序結(jié)果已經(jīng)登錄在 Genebank中，登錄號(hào)為EF998851。通過與Genebank中其他菌株16S rRNA序列的比對，認(rèn) 為菌株TP-D1屬于Oc^ra6a"n/m spp.。結(jié)合其生理生化特征將其鑒定為O. Zwp/m'。對該菌株降解百菌清的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了檢測，其主要的降解中間產(chǎn)物是TPN-0H和1,3-二酰胺-四氯苯，說明TP-Dl可通過氰基水合作用進(jìn)行降解，目前該途徑尚未在純培養(yǎng)微生物 中被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，其發(fā)現(xiàn)對實(shí)現(xiàn)百菌清的定向降解具有重要的意義，具有潛在的應(yīng)用前景。 從而本專利技術(shù)提供了一株生物降解百菌清的細(xì)菌菌株。該菌株已保藏于《中國微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中心》，其保藏號(hào)為CGMCC No. 2098。與其他百菌清降解菌相比，本專利技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是l.該菌能夠以百菌清為唯一碳源進(jìn)行降解， 前人的報(bào)道需要外加碳源才能實(shí)現(xiàn)降解菌對百菌清的降解。2.該菌對百菌清具有高效降解能 力，在無機(jī)鹽液體培養(yǎng)液中對百菌清的降解能力可達(dá)到90.4%，在土壤中對百菌清的降解能 力可達(dá)到99.7%。 3.該菌可通過氰基的水合作用降解百菌清，可利用該菌的降解酶以及工程 菌株實(shí)現(xiàn)百菌清的定向降解，避免降解代謝主要產(chǎn)物TPN-OH帶來的二次污染問題。本專利技術(shù)的可高效降解百菌清的降解菌的用途該菌株可降解殺菌劑百菌清，可用于受百菌清污染的水體、土壤或農(nóng)產(chǎn)品本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一株可高效降解殺菌劑百菌清的降解菌純培養(yǎng)物，其特征在于，它是蒼白桿菌（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ　ｌｕｐｉｎｉ）（ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．２０９８）。主要生物學(xué)特性為：Ｇ↑［－］，菌體桿狀，大小約１．６×０．７５μｍ，極生鞭毛，氧化酶、過氧化氫酶陽性、甲基紅試驗(yàn)和Ｖ－Ｐ試驗(yàn)均為陰性。精氨酸、尿氨酸、賴氨酸水解陽性，枸櫞酸鹽、尿素、蔗糖、麥芽糖、木糖、乳糖發(fā)酵陽性。七葉靈、靛基質(zhì)、硝酸鹽還原、硫化氫、ＯＮＰＧ測定為陰性。該菌株的１６Ｓ　ｒＤＮＡ序列在Ｇｅｎｅｂａｎｋ登錄號(hào)為ＥＦ９９８８５１。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：郭榮君，李世東，史秀珍，
申請(專利權(quán))人：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：11[中國|北京]