本發明專利技術公開了一種蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Ｐｐ－ＡＰ３編碼的核酸序列，所分離出的ＤＮＡ分子包括：編碼具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Ｐｐ－ＡＰ３活性的多肽核苷酸序列，該核苷酸序列與ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１中從核苷酸第７６７－８７１位的核苷酸序列有至少７０％的同源性；或者該核苷酸序列能在４０－５５℃條件下與ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１中從核苷酸第７６７－８７１位的核苷酸序列雜交。本發明專利技術還同時公開了一種蝶蛹金小蜂抗菌蛋白多肽Ｐｐ－ＡＰ３，其具有ＳＥＱ ＩＤＮＯ：２所示的氨基酸序列。本發明專利技術的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Ｐｐ－ＡＰ３具有抗菌性能。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及分子生物學、以及基因工程領域。特別是一種在蝶蛹金小蜂中表達的抗菌 蛋白Pp-AP3及其編碼的核酸序列。
技術介紹
近年來，由于藥物的濫用，藥物殘留和細菌耐藥性等問題日漸嚴重，現有的抗生素藥 物正在失去原來的療效，從而引發了人們對食品安全的關注，越來越多的國家開始呼吁禁 用抗生素，而抗菌肽(antibacterial p印tides)因其獨特的生物活性以及不同于傳統抗生素 的特殊作用機理，已引起人們的極大的研究興趣，成為分子生物學和生物化學研究領域的 熱點之一。各國的研究人員已經從哺乳動物及昆蟲、兩棲動物等中發現了幾百種抗菌肽， 其中有些已經分離提取了出來，并對其結構、抗菌活性等作了許多的研究，發現其抗菌活 性高效、廣譜，并且本身無毒、無害，對細菌、病毒、某些原蟲、真菌及腫瘤細胞等具有 選擇性殺傷作用。自1980年瑞典斯德哥爾摩大學Boman研究小組，首次由大腸桿菌注射誘導處理的惜古 比天蠶蛾滯育蛹血淋巴中提純得抗菌肽以來，國內外許多學者就昆蟲源的抗菌蛋白/肽已做 了大量的篩選、活性測定、基因克隆與表達等工作，且明確昆蟲抗菌蛋白/肽可分成天蠶素 (cecropins)、防衛素(defensins)、富含脯氨酸的抗菌肽(prolin-rich antibacterial peptides)和富含甘氨酸的抗菌肽(glycine-rich antibacterial peptides) (Brey & Hultmark, 1998)。作為地球上種類最多的生物，昆蟲具有繁殖快、適應性廣的特點；除海洋外，所有生 態環境都有昆蟲的分布。自19世紀起，昆蟲就被作為免疫防衛系統的研究對象。尚存于地 球上的昆蟲都是在劇烈的生存競爭中取得勝利后才生存下來的，它們在進化的過程中增強 了抵抗各種病原菌侵染的能力，這就為我們篩選具有抗菌作用的昆蟲抗菌蛋白/肽及其目的 基因提供了豐富的基因資源庫。眾多研究人員從不同的昆蟲中發現了數百種抗菌蛋白，但 尚未有任何文獻報道從蝶蛹金小蜂中分離得到的抗菌肽。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是提供一種具有抗菌性能的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3及 其編碼的核酸序列。為了解決上述技術問題，本專利技術提供一種蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3編碼的核酸序 列，其所分離出的DNA分子包括編碼具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp—AP3活性的多肽核苷 酸序列，該核苷酸序列與SEQIDNO: 1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列有至少70% 的同源性；或者該核苷酸序列能在40-55"C條件下與SEQ ID NO: 1中從核苷酸第767-871 位的核苷酸序列雜交。作為本專利技術的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp—AP3編碼的核酸序列的改進該序列具有SEQ IDNO: l中第767-871位的核苷酸序列。作為本專利技術的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp—AP3編碼的核酸序列的進一步改進該序列中 包含8 106個連續核苷酸。本專利技術還同時提供了一種蝶蛹金小蜂抗菌蛋白多肽Pp—AP3，其具有SEQIDNO: 2所 示的氨基酸序列。作為本專利技術的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白多肽Pp—AP3的改進蝶蛹金小蜂抗菌蛋白多肽為 多肽、其保守性變異多肽、其活性片段或其活性衍生物。本專利技術所提供的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3及其編碼的核酸序列，使其能夠應用在蝶 蛹金小蜂中表達的新的抗菌蛋白、編碼序列及其在開發成有應用價值的食品添加劑和藥物 并應用于農業、工業和食品衛生等多個領域。本專利技術的優點在于本專利技術通過基于cDNA表達性文庫的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白/肽基因 的構建及高效克隆篩選方法，以蝶蛹金小蜂為實驗材料，篩選其體內表達的抗菌蛋白。該 方法鑒于潛在抗菌蛋白/肽目的表達物能致死本身宿主菌的特點，將潛在抗菌蛋白/肽的蝶 蛹金小蜂的基因的表達與表達物抗菌活性初步測定緊密相合，進行篩選。當篩選到表達物 能使宿主菌死亡的克隆時，也就獲得了相應的源于蝶蛹金小蜂的插入之文庫中的目的基 因。具有抗菌作用基因的質粒轉化入SOLR菌后，在誘導劑IPTG (異丙基-b-d-硫代半乳糖苷)的誘導下基因表達后產生抗菌的蛋白/肽，致使菌體的細胞膜收到破壞，從而允許染料 分子進入細菌細胞，發生顯色反應，即觀察發現藍色的克隆。所以，這些被染成藍色的克 隆就是含有抗菌基因的克隆。將它們挑出后測序，就可得到相應的基因序列及其編碼的相 應的抗菌蛋白。本專利技術是通過以下技術方案實現的在本專利技術所分離出的DNA分子包括編碼具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO: 1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序 列能在40-55攝氏度條件下與SEQIDNO: 1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列雜交。 較佳的，所述的序列編碼具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的 序列具有SEQ ID NO: 1中從核苷酸第767-871位的核苷酸序列。本專利技術分離出的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3包括具有SEQIDNO: 2氨基酸序列的 多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或者其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有 SEQIDNO: 2序列的多肽。本專利技術DNA分子包含所述的DNA分子中8-106個連續核苷酸。本專利技術DNA分子轉化的宿主細胞是原核細胞。在本專利技術中，"分離的"、"純化的"DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位于 其兩側的序列中分離出來，還指該DNA片段已經與天然狀態下伴隨核苷酸的組分分開，而 且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。在本專利技術中，蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3 (或多肽)編碼的核酸序列指編碼具有蝶 蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO: 1中第767-871位核 苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQIDNO: 1序列編碼框第767-871位核 苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子取代后產生的序列。由于密 碼的簡并性，所以與SEQIDNO: 1中第767-871位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并 序列也能編碼出SEQIDNO: 1所述的序列。還包括能在中度嚴緊條件下，更佳的在高度嚴緊條件下與SEQIDNO: 1中從核苷酸 第767-871位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還包括與SEQIDNO: 1中從核苷酸第 767-871位的核苷酸序列的同源性至少70%，較佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地 至少95%的核苷酸序列。還包括能編碼具有天然的蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3相同功能 的蛋白的SEQ ID NO: 1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于) 若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、 插入/或取代，以及在5'和域3'端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳 地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。在本專利技術中蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3或多肽指具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3活性的SEQIDNO: 2序列的多肽。該術語還包括具有與天然蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Pp-AP3 相同功能的、SEQIDNO本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Ｐｐ－ＡＰ３編碼的核酸序列，其特征在于所分離出的ＤＮＡ分子包括：編碼具有蝶蛹金小蜂抗菌蛋白Ｐｐ－ＡＰ３活性的多肽核苷酸序列，所述的核苷酸序列與ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１中從核苷酸第７６７－８７１位的核苷酸序列有至少７０％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在４０－５５℃條件下與ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１中從核苷酸第７６７－８７１位的核苷酸序列雜交。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：慎小晶，葉恭銀，成雄鷹，胡萃，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發明
國別省市：86[中國|杭州]
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