本發(fā)明專利技術(shù)涉及到醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)，尤其是采用ｓｉＲＮＡ干擾技術(shù)構(gòu)建研究細(xì)胞模型。本發(fā)明專利技術(shù)所述的Ｇ６ＰＤ缺陷型Ａ３７５穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株是將Ａ３７５細(xì)胞株經(jīng)ｓｉＲＮＡ－慢病毒表達(dá)系統(tǒng)靶向沉默了內(nèi)源性Ｇ６ＰＤ的表達(dá)量８０％以上，并含有ＤＮＡ雙鏈片段以及綠色熒光蛋白ＧＦＰ基因的能發(fā)綠色熒光的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。本申請應(yīng)用ｓｉＲＮＡ－慢病毒系統(tǒng)沉默人皮膚惡性黑色素瘤Ａ３７５細(xì)胞內(nèi)源性Ｇ６ＰＤ表達(dá)８０％以上，構(gòu)建了Ｇ６ＰＤ缺陷型Ａ３７５穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，并對其功能進(jìn)行了初步探討。本細(xì)胞模型可用于探究Ｇ６ＰＤ與腫瘤的相關(guān)性及其機(jī)理；也可用于腫瘤細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的研究；還可作為人惡性黑色素瘤發(fā)病機(jī)理研究的模型。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及到醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)，尤其是采用siRNA干擾技術(shù)構(gòu)建研究細(xì)胞模型。
技術(shù)介紹
腫瘤細(xì)胞是增殖和分化失控的細(xì)胞，存在氧化一抗氧化失平衡，如卵巢癌和腎癌細(xì)胞還原 型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone, GSH)及其代謝酶(谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽過氧化 物酶等)活性的改變與臨床分期相關(guān)。GSH是真核細(xì)胞抗氧化的最主要的機(jī)制，其水平的維持 主要依賴于NADPH，而后者又主要來源于磷酸戊糖途徑。G6PD (glucose-6-phosphate dehydrogenase,葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，EC1丄1.49)是磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶，也是看家酶，在所有 組織細(xì)胞均有表達(dá)，其基因定位于基因高密度區(qū)Xq2.8 (NM一000402),全長18kb,由13個外 顯子和12個內(nèi)含子組成；mRNA全長2395 bp， cDNA為1348 bp,編碼515個氨基酸。此外， 磷酸戊糖途徑還提供五磷酸核糖，作為核酸合成的原料，與腫瘤細(xì)胞的異常增殖密切相關(guān)。人食管癌細(xì)胞G6PD可高于正常10倍以上；將高于對照2-16倍G6PD表達(dá)的NIH 3T3細(xì)胞 注射到裸鼠皮下可快速誘導(dǎo)裸鼠產(chǎn)生腫瘤，而且腫瘤的大小與G6PD活性高低相關(guān)。然而，流行病 學(xué)觀察到G6PD缺陷鼻咽癌患者預(yù)后較差，復(fù)發(fā)率高。共聚焦激光掃描顯微鏡(Confoc;al laser scanning microscopy ， CLSM)證實G6PD在凋亡的纖維肉瘤細(xì)胞低表達(dá)。OW等在檢測人膀胱 癌和前列腺癌細(xì)胞內(nèi)看家基因時，發(fā)現(xiàn)G6PD表達(dá)不穩(wěn)定并與腫瘤的惡性程度相關(guān)。國內(nèi)張德太 發(fā)現(xiàn)G6PD的非競爭性抑制劑脫氫表雄酮(Dehydrooepian—drosterane, DHEA)通過抑制細(xì)胞 G6PD酶活性可減慢Burkit淋巴瘤的生長。可見，G6PD與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、臨床表現(xiàn)及治療均有關(guān)系。然而，至今尚未闡明G6PD與 腫瘤的關(guān)系及其機(jī)理，甚至有不一致的觀點(diǎn)和結(jié)論。原因之一可能是腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性G6PD的干擾。至今為止，文獻(xiàn)報道的G6PD缺陷細(xì)胞有三個來源，均不是人的腫瘤細(xì)胞。其一是G6PD缺 陷的CJ7小鼠胚胎干細(xì)胞(CJ7 G6PDA ES )，由Filosa實驗室采用Cre/lox系統(tǒng)介導(dǎo)的位點(diǎn)特異 性重組技術(shù)，在G6PD-Loxed中瞬時表達(dá)Cre重組酶獲得，并用于氧化性損傷及其機(jī)理的研究。 第二是Pandolfi等從小鼠129sv噬菌體基因組文庫中分離得到目的基因，構(gòu)建陽性和陰性選擇 載體，經(jīng)電穿孔法轉(zhuǎn)入ABIES細(xì)胞，篩選后從156個單克隆中找到"G6PDnullEScells"，其 G6PD表的活性是正常對照的14%，用于G6PD嚴(yán)重缺陷引起的溶血性疾病基因治療的研究。 第三個G6PD缺陷的細(xì)胞是中國倉鼠卵巢細(xì)胞E89或E48 (Chinese hamster ovary cel，CHO),由Stamato等從含G6PD突變體的CHO細(xì)胞篩選得到，其活性約為CHO Kl (野生型)的10%,用 于電離輻射損傷及其機(jī)理研究。至今，在人類腫瘤研究中尚未見G6PD缺陷型細(xì)胞的報道。在我國，惡性黑色素瘤的發(fā)病率雖不高約1/10萬人口，但呈不斷上升趨勢，具有惡性程度 高、病程進(jìn)展迅速、易轉(zhuǎn)移、對常規(guī)化療和放療不敏感、預(yù)后差和死亡率高等特點(diǎn)，成為長期 困擾醫(yī)生的難題。黑色素瘤的發(fā)病機(jī)理及其研究也是亟待解決的技術(shù)難題。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的旨在提供一種G6PD缺陷型A375穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，作為模型用于研究G6PD與腫瘤的 相關(guān)性及其機(jī)理。本專利技術(shù)的另一 目的在于提供這種細(xì)胞株的構(gòu)建方法。本專利技術(shù)所述的G6PD缺陷型A375穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株是將A375細(xì)胞株經(jīng)siRNA-慢病毒表達(dá)系統(tǒng)耙 向沉默了內(nèi)源性G6PD的表達(dá)量80%以上，并含有DNA雙鏈片段CAAGTGGCACTGAGGCGG-3'，以及綠色熒光蛋白GFP基因的能發(fā)綠色熒光的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。上述的A375細(xì)胞株為現(xiàn)有技術(shù)，購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。它來源于一位54歲的女性皮膚惡 性黒色素瘤患者，由D丄Giard等人建立，貼壁生長，屬上皮細(xì)胞，具有致瘤性(使免疫抑制的 小鼠產(chǎn)生類似于惡性黑色素瘤的皮下腫瘤)。經(jīng)細(xì)胞遺傳學(xué)分析顯示為含62條同源染色體的亞 三倍體細(xì)胞，有9條標(biāo)記染色體，其DNA上的STR位點(diǎn)有Amelogenin: X; CSF1PO: 11,12; D13S317: ]1,14; D16S539: 9; D5S818: 12; D7S820: 9; TH01:8; TPOX: 8,10和vWA: 16,17。 本專利技術(shù)所述的G6PD缺陷型A375穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株是將上述DNA雙鏈片段插入含GFP綠色熒光的 pRNAT-U6.2/Lenti表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)入A375細(xì)胞株，在細(xì)胞中表達(dá)siRNA，經(jīng)陽性細(xì)胞克隆篩選， siRNA靶向沉默了內(nèi)源性G6PD的表達(dá)量80M以上，且95%以上的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白的穩(wěn)轉(zhuǎn) 細(xì)胞株。本專利技術(shù)所述的G6PD缺陷型A375穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建方法由以下步驟組成 一、siRNA序列、DNA模板的設(shè)計與合成用01igoEngineRNAi軟件設(shè)計針對人G6PD基因(GenBank: NM_000402) 3'端非編碼區(qū)的 siRNA: 5'-GCCTCAGTGCCACTTGACA-3'，并以siRNA無關(guān)序列5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'為對照，再分別合成兩條互補(bǔ)并含siRNA或?qū)φ招蛄械恼x 鏈和反義鏈的DNA模板，中間以10個脫氧核苷酸的Loop結(jié)構(gòu)相連，后接RNAPolyIII轉(zhuǎn)錄中止 點(diǎn)，并在兩端引入Bflm/Z/和;ao /酶切位點(diǎn)；對應(yīng)于人G6PD基因3，端非編碼區(qū)的siRNA的DNA 模板是TCCAAC-3'禾口 5'-TCGAGTTGGAAAAAAGCCTCAGTGCCACTTGACACGGATATCAATGT CAAGTGGCACTGAGGCGG-3':而對應(yīng)于對照序列的DNA模板是TTCCAAA -3'禾Q 5，-AGCTTTTGGAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACG TGACACGTTCGGAGAACGG- 3，；二、 構(gòu)建siRNA的慢病毒表達(dá)載體上述DNA模板分別經(jīng)稀釋、退火，與線性質(zhì)粒pRNAT-U6.2/Lenti連接；再轉(zhuǎn)化DH5ot， 涂布平板，過夜培養(yǎng)；每組樣品挑取兩個單菌落經(jīng)PCR檢測，PCR條件為94"C lOmin—94°C 30s—55°C 30s—72°C 30s，共33個循環(huán)；過夜培養(yǎng)陽性菌落，提取質(zhì)粒測序鑒定，對于測序正 確的陽性克隆，提取純化不含內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒DNA;三、 慢病毒顆粒的包裝和病毒液的生產(chǎn)用慢病毒包裝質(zhì)粒混合物和siRNA慢病毒表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；24小時換為含 1°/0FBS的DMEM培養(yǎng)液；48小時收集細(xì)胞，5000 rpm離心5min, 0.45prn的PVDF膜過濾上 清液后用作待測病毒液；以標(biāo)準(zhǔn)病毒液lxio8 Cfo/L (Colony forming unit)為對照，兩組樣品 按感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection, MOI)值設(shè)5個梯度1、 3、 5、 10和20;本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種Ｇ６ＰＤ缺陷型Ａ３７５穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，其特征在于是將Ａ３７５細(xì)胞株經(jīng)ｓｉＲＮＡ－慢病毒表達(dá)系統(tǒng)靶向沉默了內(nèi)源性Ｇ６ＰＤ的表達(dá)量８０％以上，并含有ＤＮＡ雙鏈片段５′－ＧＡＴＣＣＣＧＣＣＴＣＡＧＴＧＣＣＡＣＴＴＧＡＣＡＴＴＧＡＴＡＴＣＣＧＴＧＴＣＡＡＧＴＧＧＣＡＣＴＧＡＧＧＣＴＴＴＴＴＴＣＣＡＡＣ－３′和５′－ＴＣＧＡＧＴＴＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＣＴＣＡＧＴＧＣＣＡＣＴＴＧＡＣＡＣＧＧＡＴＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＧＴＧＧＣＡＣＴＧＡＧＧＣＧＧ－３′，以及綠色熒光蛋白ＧＦＰ基因的能發(fā)綠色熒光的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：朱月春，李丹怡，呂會茹，楊銀峰，童淑芬，李治綱，
申請(專利權(quán))人：昆明醫(yī)學(xué)院，
類型：發(fā)明
國別省市：53[中國|云南]
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