靜寧雞胚成纖維細胞系及其培養方法技術

本發明專利技術公開了一種高活率、高純度靜寧雞胚成纖維細胞系，其保藏編號為ＣＧＭＣＣ　　Ｎｏ．１８７８屬于細胞生物學領域。本發明專利技術培養出的成纖維細胞無上皮細胞等，細胞純度高；凍存細胞質量穩定，且細胞凍存后的細胞活率可達到并維持在９３．２％～９６．７％之間，傳代生長穩定，適合大規模培養。本發明專利技術涉及的靜寧雞胚成纖維細胞系可以為醫學、細胞和分子生物學等生命科學研究提供大量高品質材料；并可以作為禽體細胞克隆育種的供體細胞；在農業上可以改良地方禽品種及可以作為地方優良禽品種保種的手段；還可以作為是疫苗生產的主要原材料及肝細胞培養的飼養層；同時可用于細胞凋亡及細胞融合研究之用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種細胞系及其培養方法，具體地說是利用靜寧雞胚胎進行初代培養、傳代培養獲得高活率、高純度靜寧雞胚成纖維細胞系，屬于細胞生物學領域。
技術介紹
隨著科技的發展和人們物質生活需求的不斷提高，畜牧業生產正朝著高產、優質、抗逆、抗病及集約化的方向快速轉變和發展。在大多數發達國家里，由于人們過于追求經濟利益等緣故，大量繁育的畜禽只是少數經濟價值高的品種和雜交種，因而，導致了而很多產量不高、品質不佳、抗逆和抗病力差的地方品種的瀕臨滅絕，甚至滅絕。雖然相關的國際組織、政府部門和專家學者對畜禽遺傳資源的保存和管理工作相當重視，但畜禽種質資源仍在大量喪失，遺傳多樣性遭到了前所未有的破壞，并且危機程度日益加劇。 1995年，FAO的統計數據表明在撒哈拉沙漠以南的中部非洲地區登記在案的畜禽約有738個品種，將近15％為瀕危畜禽資源。非洲地區的形式非常嚴峻，畜禽遺傳資源已慘遭破壞，從1995年至今，處于瀕臨滅絕的家禽由20％上升到了34％。亞太地區擁有全球1/5的畜禽資源，1251個畜禽品種被登記，據估計在所被記錄的品種中，約有10％為瀕危資源。在1995年到1999年間，亞洲瀕臨滅絕的家禽由32％上升到37％。在東歐這種情況更為嚴重，在1995年到1999年的幾年時間里，處于瀕臨滅絕的家禽由65％上升到了76％。拉丁美洲現存20％的品種被認為處于瀕危。處于瀕危狀態的禽類由1995年的5％急劇上升到了1999年的45％。近東地區生產的集約化和機械化導致了很多畜禽品種的瀕臨滅絕。在571個被登記的品種中，有44個甚至更多被認為是處于瀕危狀態。北美持續的生產集約化，使得在生產中僅依賴少數的品種來滿足食品生產的需求，因此加重了畜禽遺傳資源多樣性的危機程度，在被記錄的259個品種中，有35％瀕臨滅絕。據2000年聯合國糧農組織(FAO)與聯合國環境規劃署的報道，目前全球畜禽品種以每周減少2個品種的速度在喪失，在被FAO所記錄的2576個畜禽品種中，幾乎半數被認為是瀕危畜禽資源，約有1350個品種面臨滅絕，使世界畜禽種質資源出現越來越狹窄的格局，因此挽救和保護瀕危畜禽品種已成為當務之急。 我國畜禽生產力類型豐富，其遺傳資源具有物種和品種繁多，起源和分布廣泛，生態類型多樣等特點，且我國地方品種所占的比例遠遠高于其他國家。我國畜禽具有對疫病抵抗力強的特性，具有各種抗性和經濟性狀的優良基因。 但是，近些年來，由于生態環境的不斷惡化、國外畜禽品種的大量引進和集約化養殖等諸多因素的影響，導致我國很多優良地方畜禽品種的滅絕或處于瀕臨滅絕狀態。近20年，41.9％的地方品種群體數量有不同程度的下降。80年代中后期雞的配套系又取代了本地雞品種和新培養品種，致使我國家養動物種質資源受到嚴重破壞。我國的畜禽遺傳資源多樣性狀況也并不樂觀，而且有不斷惡化的趨勢。畜禽種質資源的危機，意味著畜禽種質所攜帶基因的危機，甚至是基因的永遠消失，意味著畜禽遺傳資源多樣性的衰退和喪失。品種的滅絕意味著細胞和分子生物學對其進行科學研究的基本材料的永遠喪失，如果這些品種的種質資源在滅絕前未曾以任何方式保存下來，不僅永遠喪失了其基因資源，而且使科學家們對于它們諸多未知的細胞和分子生物學機理的探索及通過體細胞克隆技術使之再現的愿望將永遠成為謎和夢，同時也將是世界遺傳資源遺產和生命科學理論寶庫的巨大損失。因此，在全球性搶奪生物資源和保護生物多樣性的今天，從我國畜禽種質資源保存的實際出發，通過構建重要、瀕危畜禽品種群體細胞庫的方式來保存其基因資源，具有重要意義。 近年來，由于體外培養細胞在遺傳資源保存和生命科學研究等諸多方面具有巨大的科學價值和應用價值，已引起各國政府高度重視。除美國外，日本大阪發酵所(IFO)、德國培養物保藏所(DSM)等都在逐漸擴大保藏范圍，將細胞培養物列入保藏對象。 目前，低溫冷凍保存技術的發展和完善，使得任何體外培養物都可以在保持其活力的基礎上無限期地得以保存，因此，對于動物細胞的大量培養以解決種質資源問題無疑是現階段細胞生物學領域研究的重要問題。 靜寧雞是原產于我國甘肅靜寧的卵肉兼用型地方良種家禽。它的頭部高舉，尾羽高聳，胸肌發達，背寬而長。公雞多為玫瑰冠，毛色紅棕及醬紅色為主，主翼羽、主尾羽均為黑色，外觀美麗；母雞頭小清秀，黃色占大部分，麻色占的比例也不少，其肉質鮮美細嫩，目前采用農戶分散飼養，山區以放牧為主。但是，由于近幾十年來自然環境的污染和惡化，靜寧雞的種質資源已經嚴重匱乏，在絕大多數地區已經滅絕，在小部分地區也只還存在有限的數目，而目前人工繁育所面臨的多方面技術問題導致其繁育效果不佳，我國靜寧雞面臨瀕臨滅絕的危險。更由于其種質資源的匱乏，使生物學、醫學等領域對于靜寧雞的研究也成為空白。因此，為保護國家珍惜禽種，一個最優的方法是對靜寧雞成纖維細胞的大規模培養并加以保藏。 目前隨著生物技術的發展，迫切需要大規模的細胞培養，以便獲得大量有用的細胞表達產物。但是，由于靜寧雞成纖維細胞生長緩慢，對培養環境十分敏感，若直接從組織塊原代培養其所獲得的細胞數量少，細胞類型多而雜，如成纖維細胞中常混雜有上皮細胞，隨著培養時間的延長，培養物所含各種類型細胞間的生長期限出現差異，有的細胞類型經過適應生長階段而加速繁殖生長，而另一些細胞，或者死亡，或者經過逐步退化而至死亡。而第一代細胞培養技術核心問題是難以產業化或者說是規模化生產一是在工藝生產時不能大規模制備產品；二是非批量生產容易導致產品質量的不均一性；三是難以對同批生產進行生產和質量控制。而采用玻璃瓶靜置或旋轉瓶的培養方法，也已不能滿足所需細胞數量及其分泌產物。目前使用較多的反應器培養雖可以獲得高密度細胞，但是擴大規模較難，只適合于少量、價值高的細胞培養。 目前，常采用EB病毒轉化技術、貼壁培養法和膠原酶消化技術進行禽類品種體外細胞的大量培養，但對比試驗結果表明EB病毒轉化技術對于禽類品種的體外細胞培養并不適用，其培養的細胞活率及純度均不能達到所需標準，EB病毒轉化技術對于人類和靈長類動物的細胞培養效果要優于禽類細胞培養；膠原酶消化技術和貼壁培養法獲得的原代細胞分別經傳代后接種，細胞群體倍增時間(PDT)分別為35.9h和48h。但前者操作步驟繁雜，不適合于體外大規模化細胞的培養，后者簡單易行，適合于體外大規模化細胞的培養。因此建立細胞系以采用后者為佳。對于禽類細胞保藏而言，細胞純度及活性均有較高的要求，目前，貼壁培養方法存在諸多弊端，如方法單一、成本過高、細胞活性及純度偏低、細胞凍存復蘇后死亡率過高等。因此，現在急需對其方法改進使靜寧雞成纖維細胞達到高細胞活率高純度的標準已得到很好的保藏并延續下去。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種高細胞活性、高細胞純度的靜寧雞胚成纖維細胞系，其保藏號為CGMCC No.1878。 本專利技術的另一目的在于提供上述細胞系的培養方法。 為實現上述目的，本專利技術采取以下技術方案一種高活率、高純度靜寧雞胚成纖維細胞系，并在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，CGMCC(地址北京市海淀區中關村北一條13號；郵編100080；電話010-62542758)，保藏日2006年12月1日，保藏號CGMCC No.1878，建議的分類命名為靜寧雞本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種靜寧雞胚成纖維細胞系，其特征在于，其保藏編號為ＣＧＭＣＣＮｏ．１８７８。

【技術特征摘要】
1.一種靜寧雞胚成纖維細胞系，其特征在于，其保藏編號為CGMCC No.1878。2.一種靜寧雞胚成纖維細胞系的培養方法，其特征在于，該方法包括下述步驟(1)初代培養將除去腦、眼、四肢、內臟的靜寧雞胚胎用PBS漂洗3～4次后剪切成0.5～1.5mm3的組織塊；將組織塊移入培養瓶，倒置培養瓶，并在37.5℃，5％CO2的CO2培養箱中培養3～4h；組織塊完全貼壁后加入培養基6～10ml，培養基成分MEM+10％胎牛血清，繼續培養10～12h；(2)傳代培養棄除步驟(1)培養瓶內的培養液，用PBS洗滌培養瓶內殘留物2次后，用胰蛋白酶消化后加入全培養液(10％FBS的MEM)6～10ml終止消化；消化后的細胞平均分裝入2個培養瓶中，放入37.5℃，5％CO2的CO2培養箱中繼續培養至凍存前24h；(3)細胞凍存A、凍存前24h棄除培養瓶內培養液并更換新鮮培養液6～10ml，培養液成分MEM+10％胎牛血清，繼續培養24h；B、用胰蛋白酶消化培養細胞，然后加入全培養液6～10ml終止反應；C、用紅細胞計數板計算凍存前細胞總數；D、收集1000rpm離心6～1...

【專利技術屬性】
技術研發人員：關偉軍，馬月輝，劉長青，包阿東，王有柱，劉學東，
申請(專利權)人：中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，
類型：發明
國別省市：11[中國|北京]