仔豬水腫病大腸桿菌基因突變株及其構建方法技術

本發明專利技術提供仔豬水腫病大腸桿菌基因突變株及其構建方法。設計擴增編碼類志賀氏毒素Ⅱ型變異體基因及其左側翼序列的特異性引物；通過ＰＣＲ擴增獲得編碼類志賀氏毒素Ⅱ型變異體基因及其左側翼序列，分別進行克隆、測序鑒定；設計兩對針對基因進行定點突變的突變引物；ＰＣＲ擴增兩個突變片斷，分別克隆、測序鑒定；利用二重ＰＣＲ將兩個突變片斷連接起來，并克隆、測序鑒定；將突變的基因亞克隆至自殺質粒ｐＣＶＤ４４２中；誘導致水腫病的０１３９大腸桿菌的萘啶酮酸抗性；利用突變菌株無Ａｍｐ及蔗糖抗性，而具有萘啶酮酸抗性，并且其基因ＰＣＲ產物可特異性的被Ｓｔｕ　　Ｉ核酸內切酶切開成功篩選出完成同源重組的０１３９大腸桿菌突變株。可以為仔豬水腫病的常規預防提供一種較好的疫苗后備菌株。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及的是基因工程制品的制作方法，具體地說是利用定點突變和同源重組技術對編碼類志賀氏毒素II型變異體蛋白的SLT-IIe基因進行改造的方法。
技術介紹
仔豬水腫病是斷奶仔豬常發的一種細菌性傳染病，本病發病率不高，但死亡率很高，尤其是對健康狀況好的仔豬發病較多，給養殖戶造成巨大損失，但目前市場上的水腫疫苗仍是以常規滅活疫苗為主。因在疫苗的滅活過程中常常會影響疫苗的免疫原從而使疫苗的免疫保護性降低。因此，研制更加安全有效的疫苗成為目前十分迫切的需要。(三)專利技術目的本專利技術的目的在于提供一種利用定點突變及同源重組技術構建。本專利技術的目的是這樣實現的類志賀氏毒素II型變異體是由SLT-IIe基因編碼，該基因含有1236個堿基，編碼410個氨基酸殘基，其167位的谷氨酸和170位的精氨酸兩個氨基酸是整個基因的活性部位，分別突變為谷氨酰胺和亮氨酸后，突變體失去了原基因的致病性而保留了其免疫原性，可以刺激機體產生特異性抗體。仔豬水腫病大腸桿菌(0139)SLT-IIe基因的核苷酸序列及其推導的氨基酸序列為1 ATG AAG TGT ATA TTG TTA AAG TGG ATA CTG TGT CTG TTA CTG GGT TTT TCT TCG GTA TCC1 M K C I L L K W I L C L L L G F S S V S61 TAT TCC CAG GAG TTT ACG ATA GAC TTT TCG ACT CAA CAA AGT TAT GTA TCT TCG TTA AAT21 Y S Q E F T I D F S T Q Q S Y V S S L N121 AGT ATA CGG ACA GCG ATA TCG ACC CCT CTT GAA CAT ATA TCT CAG GGA GCT ACA TCG GTA41 S I R T A I S T P L E H I S Q G A T S V181 TCC GTT ATT AAT CAT ACA CCA CCA GGA AGT TAT ATT TCC GTA GGT ATA CGA GGG CTT GAT61 S V I N H T P P G S Y I S V G I R G L D241 GTT TAT CAG GAG CGT TTT GAC CAT CTT CGT CTG ATT ATT GAA CGA AAT AAT TTA TAT GTG81 V Y Q E R F D H L R L I I E R N N L Y V301 GCT GGA TTT GTT AAT ACG ACA ACA AAT ACT TTC TAC AGA TTT TCA GAT TTT GCA CAT ATA101 A G F V N T T T N T F Y R F S D F A H I361 TCA TTG CCC GGT GTG ACA ACT ATT TCC ATG ACA ACG GAC AGC AGT TAT ACC ACT CTG CAA121 S L P G V T T I S M T T D S S Y T T L Q421 CGT GTC GCA GCG CTG GAA CGT TCC GGA ATG CAA ATC AGT CGT CAC TCA CTG GTT TCA TCA141 R V A A L E R S G M Q I S R H S L V S S481 TAT CTG GCG TTA ATG GAG TTC AGT GGT AAT ACA ATG ACC AGA GAT GCA TCA AGA GCA GTT161 Y L A L M E F S G N T M T R D A S R A V541 CTG CGT TTT GTC ACT GTC ACA GCA GAA GCC TTA CGG TTC AGG CAA ATA CAG AGA GAA TTT181 L R F V T V T A D A L R F R Q I Q R E F601 CGT CTG GCA CTG TCT GAA ACT GCT CCT GTT TAT ACG ATG ACG CCG GAA GAC GTG GAC CTC201 R L A L S E T A P V Y T M T P E D V D L661 ACT CTG AAC TGG GGG AGA ATC AGC AAT GTG CTT CCG GAG TAT CGG GGA GAG GCT GGT GTC221 T L N W G R I S N V L P E Y R G E A G V721 AGA GTG GGG AGA ATA TCC TTT AAT AAT ATA TCA GCG ATA CTT GGT ACT GTG GCC GTT ATA241 R V G R I S F N N I S A I L G T V A V I781 CTG AAT TGC CAT CAT CAG GGC GCG CGT TCT GTT CGC GCC GTG AAT GAA GAG AGT CAA CCA261 L N C H H Q G A R S V R A V N E E S Q P841 GAA TGT CAG ATA ACT GGC GAC AGG CCC GTT ATA AAA ATA AAC AAT ACA TTA TGG GAA AGT281 E C Q I T G D 本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種仔豬水腫病大腸桿菌基因突變株，其特征是：突變后的ＳＬＴ－Ⅱｅ＊基因特征為：完整的ＳＬＴ－Ⅱｅ＊基因有兩個開放閱讀框，共１２３６個堿基，編碼４１０個氨基酸殘基，與野生的仔豬水腫病大腸桿菌０１３９編碼類志賀氏毒素Ⅱ型變異體的ＳＬＴ－Ⅱｅ僅有３個堿基的變異，共有２個氨基酸殘基的變異。

【技術特征摘要】
1.一種仔豬水腫病大腸桿菌基因突變株，其特征是突變后的SLT-IIe*基因特征為完整的SLT-IIe*基因有兩個開放閱讀框，共1236個堿基，編碼410個氨基酸殘基，與野生的仔豬水腫病大腸桿菌0139編碼類志賀氏毒素II型變異體的SLT-IIe僅有3個堿基的變異，共有2個氨基酸殘基的變異。2.根據權利要求1所述的仔豬水腫病大腸桿菌基因突變株，其特征是豬大腸桿菌SLT-IIe基因的突變基因SLT-IIe*基因序列為1 ATG AAG TGT ATA TTG TTA AAG TGG ATA CTG TGT CTG TTA CTG GGT TTT TCT TCG GTA TCC1 M K C I L L K W I L C L L L G F S S V S61 TAT TCC CAG GAG TTT ACG ATA GAC TTT TCG ACT CAA CAA AGT TAT GTA TCT TCG TTA AAT21 Y S Q E F T I D F S T Q Q S Y V S S L N121 AGT ATA CGG ACA GCG ATA TCG ACC CCT CTT GAA CAT ATA TCT CAG GGA GCT ACA TCG GTA41 S I R T A I S T P L E H I S Q G A T S V181 TCC GTT ATT AAT CAT ACA CCA CCA GGA AGT TAT ATT TCC GTA GGT ATA CGA GGG CTT GAT61 S V I N H T P P G S Y I S V G I R G L D241 GTT TAT CAG GAG CGT TTT GAC CAT CTT CGT CTG ATT ATT GAA CGA AAT AAT TTA TAT GTG81 V Y Q E R F D H L R L I I E R N N L Y V301 GCT GGA TTT GTT AAT ACG ACA ACA AAT ACT TTC TAC AGA TTT TCA GAT TTT GCA CAT ATA101 A G F V N T T T N T F Y R F S D F A H I361 TCA TTG CCC GGT GTG ACA ACT ATT TCC ATG ACA ACG GAC AGC AGT TAT ACC ACT CTG CAA121 S L P G V T T I S M T T D S S Y T T L Q421 CGT GTC GCA GCG CTG GAA CGT TCC GGA ATG CAA ATC AGT CGT CAC TCA CTG GTT TCA TCA141 R V A A L E R S G M Q I S R H S L V S S481 TAT CTG GCG TTA ATG GAG TTC AGT GGT AAT ACA ATG ACC AGA GAT GCA TCA AGA GCA GTT161 Y L A L M E F S G N T M T R D A S R A V541 CTG CGT TTT GTC ACT GTC ACA GCA CGA GCC TTA CTG TTC AGG CAA ATA CAG AGA GAA TTT181 L R F V T V T A Q A L L F R Q I Q R E F601 CGT CTG GCA CTG TCT GAA ACT GCT CCT GTT TAT ACG ATG ACG CCG GAA GAC GTG GAC CTC201 R L A L S E T A P V Y T M T P E D V D L661 ACT CTG AAC TGG GGG AGA ATC AGC AAT GTG CTT CCG GAG TAT CGG GGA GAG GCT GGT GTC221 T L N W G R I S N V L P E Y R G E A G V721 AGA GTG GGG AGA ATA TCC TTT AAT AAT ATA TCA GCG ATA CTT GGT ACT GTG GCC GTT ATA241 R V G R I S F N N ...

【專利技術屬性】
技術研發人員：師東方，付海兵，
申請(專利權)人：東北農業大學，
類型：發明
國別省市：93[中國|哈爾濱]