一種注射用人體軟組織填充劑及其制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種注射用人體軟組織填充劑及其制備方法，系將來源于治療者自體的皮膚經(jīng)過消化分離，得到的真皮成纖維干細(xì)胞、成纖維前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外全程無血清充分培養(yǎng)后，將收集到的有效成分與濃度５％的葡萄糖注射液或其它注射液以及任選項(xiàng)的其它適用成分制成混懸液，有效成分選自真皮成纖維干細(xì)胞、成纖維前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞中的至少一種及膠原蛋白，每毫升混懸液含有１０００－８０００萬(wàn)個(gè)有效細(xì)胞成分，膠原蛋白的含量為１０－１００ｍｇ／ｍｌ注射用填充劑。本發(fā)明專利技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是：使用的材料取自治療者自體，無排斥反應(yīng)及副作用，治療后見效快，療效顯著，表情自然，效果作用持久，可維持?jǐn)?shù)年。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種細(xì)胞類組織填充劑，用于人體軟組織的填充和修復(fù)，包括除去皺紋和修復(fù)凹陷性疤痕。在其組織填充劑中包含了經(jīng)體外培養(yǎng)、擴(kuò)增后的自體的成纖維干細(xì)胞、成纖維前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和膠原蛋白。其制備過程應(yīng)用了無血清培養(yǎng)材料，最終制備成組織填充劑的注射懸浮液，注射到皺紋、凹陷性疤痕、創(chuàng)傷性皮膚真皮中、以及嘴唇等部位，以達(dá)到填充，修復(fù)的目的。
技術(shù)介紹
通常應(yīng)用于人體軟組織填充的方法可分為真皮填充和皮下填充，這些填充劑以往都不是自體組織活體材料，而是生物合成材料或者異性蛋白。最早應(yīng)用填充材料是在十九世紀(jì)末，它以石蠟作為填充劑，出現(xiàn)了許多并發(fā)癥，前期效果也不好。六十年代又應(yīng)用了硅氧烷溶液作為填充劑，也同樣出現(xiàn)了局部和全身性反應(yīng)。隨后又應(yīng)用外源性蛋白作為填充材料，尤其是牛的膠原蛋白填充劑，這種填充劑可以立刻得到治療效果，但三到六個(gè)月內(nèi)被組織消化吸收。牛的膠原蛋白制備和利用可見美國(guó)專利3,949,073和4,424,208及4,488,911。其規(guī)格為35mg/ml及65mg/ml，商品名為ZydermI、ZydermII、ZydermIII，在使用Ryder后，90％受治者有抗體產(chǎn)生，1-3％的受治者產(chǎn)生了明顯的過敏反應(yīng)而不能令人滿意；因而應(yīng)用戊二醛交聯(lián)，然后用細(xì)篩過濾，產(chǎn)生出一種Zyplast的交聯(lián)牛膠原蛋白，從而克服過敏的反應(yīng)，其制備過程見美國(guó)專利4,582,640和4,642,117，但其治療效果又出現(xiàn)了不平整的問題，是因?yàn)槲於┙宦?lián)后得到的材料粘性太大。對(duì)應(yīng)用過牛膠原蛋白的受試者調(diào)查表明，一個(gè)處理過程的效果一般只能持續(xù)4-6月。為了消除牛膠原的免疫反應(yīng)，有人從人的胎盤中提取人膠原，像美國(guó)曾經(jīng)出售過的品牌AUTOLOGEN，見美國(guó)專利4,969,912和5,332,802，但也只能維持幾個(gè)月的時(shí)間。美國(guó)市場(chǎng)上也出現(xiàn)過一種稱為FIBREL的軟組織填充劑，它是明膠粉末和氨基乙酸以及受治者的血漿的混合物，它對(duì)部分受治者有效，但易出現(xiàn)注射部位團(tuán)塊和療效不持久等問題。肉毒素(BOTOX)是一種近年來應(yīng)用廣泛的短期注射除皺液，于2004年4月獲得FDA的批準(zhǔn)，進(jìn)行臨床應(yīng)用。依靠其可以使面部運(yùn)動(dòng)肌肉麻醉而達(dá)到治療效果。因?yàn)樵撝苿┎僮骱?jiǎn)便，立即見效而聞名，但其治療后出現(xiàn)面部表情僵化，療效短，也有些出現(xiàn)面癱的問題。愛貝芙(Artecoll)是人工合成顆粒和牛膠原蛋白的復(fù)合物，已在加拿大、墨西哥和歐洲應(yīng)用多年。通過該材料刺激局部真皮而誘導(dǎo)產(chǎn)生自體膠原來達(dá)到長(zhǎng)期有效的目的，療效上也出現(xiàn)了治療者觸摸有顆粒感等問題，16％的治療者的治療部位出現(xiàn)突出腫塊。由于異體材料注射后常出現(xiàn)過敏、排異反應(yīng)和療效短等問題，美國(guó)Isolagen公司1995年開始在門診上應(yīng)用一種培養(yǎng)自體真皮成纖維細(xì)胞修復(fù)皮膚和軟組織缺損的治療方法(見美國(guó)專利5,591,444、5,665,372、5,660,850)，其具體做法是，應(yīng)用自體取得的皮膚組織，在體外應(yīng)用含有牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，最后制備于林格斯液中而得到自體成纖維細(xì)胞注射液，它無嚴(yán)重的過敏、排斥反應(yīng)。但是美國(guó)FDA從2000年開始對(duì)于應(yīng)用動(dòng)物血清制備的、用于人的注射液提出了限用和禁用的要求，并且受試者對(duì)于牛血清疑帶有瘋牛病等病毒的潛在危險(xiǎn)提出了質(zhì)疑，因而Isolagen公司重新開始了三期臨床試驗(yàn)。該方法的另一個(gè)不足之處是，林格斯液不便于較長(zhǎng)時(shí)間地保持有效成分的活性，配制成了注射劑后需要很快使用，實(shí)際使用中不方便。北京以嶺生物工程有限公司從2000年開始開發(fā)得到的一種除皺祛疤的注射劑(中國(guó)專利申請(qǐng)第03155833.X號(hào))中，應(yīng)用了自體皮膚，經(jīng)體外分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增，制成于葡萄糖液中的一種注射劑，治療疤痕和祛除皺紋。按照中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?3155833.X的注射劑中的有效成分是用部分含血清的培養(yǎng)液對(duì)自體皮膚樣品進(jìn)行組織培養(yǎng)而得到的。在當(dāng)時(shí)的分析技術(shù)水平下，其中的有效成分都被表征為成纖維細(xì)胞；但經(jīng)現(xiàn)有分析手段測(cè)定，培養(yǎng)和擴(kuò)增后的有效成分不僅含有成纖維細(xì)胞，還含有成纖維干細(xì)胞、成纖維前體細(xì)胞和少量的膠原蛋白。該技術(shù)的不足之處是，注射劑中能立即發(fā)揮人體軟組織的填充和修復(fù)功能的膠原蛋白含量較低，導(dǎo)致注射到疤痕和皺紋處后見效較慢，一般要4-6個(gè)月；另外，受治者對(duì)使用動(dòng)物血清作為培養(yǎng)液的成分也可能存有安全性方面的疑惑。近來，申請(qǐng)人應(yīng)用無血清培養(yǎng)液，從自體皮膚組織中培養(yǎng)出了既可包含大量自體的成纖維干細(xì)胞、成纖維前體細(xì)胞和成纖維細(xì)胞、同時(shí)又含有豐富的自體膠原蛋白的復(fù)合填充劑，在1-3個(gè)月就可出現(xiàn)明顯的填充和修復(fù)效果，其見效快，療效持久，自然安全。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的一個(gè)目的是提供一種新的自體注射用人體軟組織填充劑，它可以用于美容、改善皮膚彈性和光澤、以及其它部位和類型的填充，自然、療效持久。本專利技術(shù)的另一個(gè)目的是提供這種注射用填充劑在美容、改善皮膚彈性和光澤、以及其它部位和類型的填充和修復(fù)中的應(yīng)用。本專利技術(shù)的另一個(gè)目的是提供這種注射用填充劑的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)方案按本專利技術(shù)的注射用人體軟組織填充劑由來源于治療者自體的皮膚經(jīng)過消化分離，得到的真皮成纖維干細(xì)胞、成纖維前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外全程無血清培養(yǎng)和擴(kuò)增后，再與濃度5％的葡萄糖注射液或其它注射液、以及任選的其它適用成分配成，有效成分由選自培養(yǎng)后收集到的真皮成纖維干細(xì)胞、成纖維前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞中的至少一種和膠原蛋白組成；在每毫升填充劑中，有效細(xì)胞成分的總個(gè)數(shù)為1000-8000萬(wàn)個(gè)，膠原蛋白的含量為10-100mg/ml，優(yōu)選20-60mg/ml。按本專利技術(shù)的組織填充劑的一個(gè)優(yōu)選方案，所述的填充劑中的自體真皮成纖維干細(xì)胞、成纖維前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、膠原蛋白是將來源于治療者自體的少量皮膚(1-30平方毫米的皮膚)，在細(xì)胞培養(yǎng)室經(jīng)過消化分離，得到的真皮成纖維干細(xì)胞、成纖維前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，在加入了生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)材料的無血清培養(yǎng)液中進(jìn)行體外培養(yǎng)和擴(kuò)增而最終得到的；采用了較長(zhǎng)的體外培養(yǎng)和擴(kuò)增時(shí)間，優(yōu)選6-10周。按本專利技術(shù)的組織填充劑的一個(gè)優(yōu)選方案，填充劑中的有效成分由所說的自體真皮成纖維干細(xì)胞、成纖維前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及膠原蛋白和膠原蛋白共同組成，成纖維干細(xì)胞、成纖維前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞之間的個(gè)數(shù)比例范圍為5-20 20-5 30-70；膠原蛋白的重量比例10-100mg/ml，優(yōu)選20-60mg/ml注射填充劑。附圖說明附圖1是成纖維干細(xì)胞在100倍光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)照片；附圖2是成纖維前體細(xì)胞在100倍光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)照片；附圖3是成纖維細(xì)胞在100倍光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)照片。本專利技術(shù)所采集的皮膚組織包括從耳后，切眼袋，切眉，以及其他部位所取的皮膚，為包括表皮和真皮的皮膚。成纖維干細(xì)胞、成纖維前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和膠原蛋白的鑒定和表征方式為成纖維干細(xì)胞采用Brdu抗體測(cè)定(黃暉，賴西南，王正國(guó)，王麗麗，創(chuàng)傷愈合中物質(zhì)對(duì)表皮干細(xì)胞遷移及受體表達(dá)的作用；中華創(chuàng)傷雜志2004年；20(3)142-145.利用核標(biāo)記物)，細(xì)胞形態(tài)可參見說明書附圖1。成纖維前體細(xì)胞在100倍光學(xué)顯微鏡下做形態(tài)學(xué)觀察，其標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)為細(xì)小長(zhǎng)索狀，細(xì)胞形態(tài)可參見說明書附圖2。成纖維細(xì)胞在100倍光學(xué)顯微鏡下做形態(tài)學(xué)觀察，其標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)為呈多觸突的長(zhǎng)索形細(xì)胞，細(xì)胞形本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種注射用人體軟組織填充劑，其特征在于：由來源于治療者自體的皮膚經(jīng)過消化分離，得到的真皮成纖維干細(xì)胞、成纖維前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外全程無血清培養(yǎng)和擴(kuò)增后，將收集到的有效成分與濃度５％的葡萄糖注射液或其它注射液、以及任選的其它適用成分配成，有效成分由選自培養(yǎng)后收集到的真皮成纖維干細(xì)胞、成纖維前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞中的至少一種和膠原蛋白組成；每毫升注射用填充劑中，有效細(xì)胞成分的總個(gè)數(shù)為１０００－８０００萬(wàn)個(gè)，膠原蛋白的含量為１０－１００ｍｇ／ｍｌ注射用填充劑。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：韓斌，田書彥，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：呂偉光，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：11[中國(guó)|北京]