形成二硫鍵以及糖基化蛋白質的方法和試劑技術

形成二硫鍵的方法和試劑，具體地在蛋白質、肽和氨基酸中形成二硫鍵的方法和試劑。該方法和試劑特別適用于蛋白質、肽和氨基酸的受控糖基化。該方法使用硫代磺酸酯或硒硫化物作為試劑或者中間物。一些包括硒硫基的蛋白質和肽也構成了本發明專利技術的部分。（*該技術在2024年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】本申請涉及形成二硫鍵和/或用于化學改性蛋白質的試劑和方法，具體地涉及用于蛋白質糖基化的試劑和方法。蛋白質的共翻譯糖基化和翻譯后糖基化在它們的生物學行為和穩定性中起到至關重要的作用(R.Dwek，Chem.Rev.，96；683-720(1996))。例如，糖基化在基本生物過程(例如，細胞信號傳導和調節、發育和免疫)中起到主要作用。由于糖蛋白類自然形成所謂的糖形的混合物的事實，難以對這些行為進行研究，所述糖形具有相同的肽主鏈，但是在糖基化的本性和位點上均不同。而且，因為蛋白質糖基化并不受直接遺傳控制，所以哺乳動物細胞培養中治療性糖蛋白類的表達導致不均勻的糖形混合物。因此，合成均勻糖蛋白糖形的能力不僅是準確研究目的的先決條件，而且當制備治療性糖蛋白(目前市場上，該治療性糖蛋白以多糖形混合物(例如，促紅細胞生成素和白細胞介素)的形式銷售)時具有增加的重要性。蛋白質的其它翻譯后改性，例如磷酸化和甲基化，也是重要的。因此，控制這些蛋白質改性的程度和本性使得可以研究和控制其在生物體系內的行為(B.G.Davis，Science，Vol 303，p 480-482，2004)。許多蛋白質糖基化的方法是已知的，包括化學合成。糖蛋白類的化學合成提供了一些優點，相當重要的是，能夠獲得純的糖蛋白糖形。一種已知的合成方法使用硫醇基-選擇性碳水化合物試劑、糖基甲烷硫代磺酸酯試劑(glyco-MTS)。這種糖基甲烷硫代磺酸酯試劑與蛋白質中的硫醇基反應，以引入糖基殘基，該糖基殘基通過二硫鍵與蛋白質連接(參見，例如WO00/01712)。然而，glyco-MTS試劑經受許多不利之處，包括偶爾適度的反應產量、它們制備中的困難和在它們經常使用的基本條件下的穩定性問題。因此，需要適用于蛋白質糖基化的其它試劑，該試劑容易制備，穩定并產生高產量的糖基化蛋白質產物。還需要替代性蛋白質糖基化的方法，所述方法產生高產量的糖基化蛋白質產物且是位點選擇性的，并且該方法使得在大量不同蛋白質中的單和多位點處進行糖基化。本專利技術的專利技術人預料不到地發現某些含硫和硒的糖基化試劑能夠以高產率相對簡單地制備，并且通常比相應的glyco-MTS試劑更穩定，并可用于糖基化大量含硫醇基的化合物(包括蛋白質)。在第一方面，本專利技術因此提供形成二硫鍵(-S-S-)的方法，該方法包括使包含至少一個硫醇基(-SH)的有機化合物與通式I的化合物反應，R-S-X-R1I其中X表示SO2或Se，優選為Se；R表示有機部分(organic moiety)，例如烷基、鏈烯基、炔烴基或碳水化合物部分；以及R1表示任選被取代的烷基、任選被取代的苯基、任選被取代的吡啶基或任選被取代的萘基；條件是，當X表示SO2時，那么R1不表示任選被取代的烷基。優選地，包含至少一個硫醇基的有機化合物是氨基酸、肽或蛋白質。在第二方面，本專利技術還提供化學改性包含至少一個硫醇基(-SH)的蛋白質、肽或氨基酸的方法，所述方法包括使所述蛋白質、肽或氨基酸與上述定義的通式I化合物反應。在另一方面，本專利技術提供通式I的化合物，其中R表示碳水化合物部分。當R表示鏈烯基或炔烴基時，存在的可能性是，通過在基團R中的C＝C或C≡C鍵處反應可進一步精細改性與通式I的化合物反應形成的二硫化合物。本專利技術的專利技術人已經預料不到地發現，含硫醇基的蛋白質可轉換為相應的硒硫化物(selenenylsulfide)，如此生成的S-Se鍵中硫的親電特性使得其容易被含硫醇基的化合物(包括碳水化合物)親核取代。在第三方面，本專利技術因此提供化學改性包含至少一個硫醇基(-S-H)的蛋白質、肽或氨基酸的方法，所述方法包括將所述硫醇基轉換為硒硫基(-S-Se-R2)。因此，該方法允許制備包含至少一個硒硫基的蛋白質、肽或氨基酸。這種包含至少一個硒硫基(selenenylsulfide group)的蛋白質、肽和氨基酸形成了本專利技術的另一特征。特別優選的是包含至少一個硒硫基的蛋白質或肽。蛋白質、肽或氨基酸中的硒硫基可進一步與包含硫醇基的有機化合物反應，生成進一步化學改性的蛋白質、肽或氨基酸，其中該有機基團通過二硫鍵連接至蛋白質、肽或氨基酸。優選地，含硫醇基的有機化合物是碳水化合物，從而提供糖基化氨基酸、肽或蛋白質的方法。如此處所使用的，″糖基化″是指通過共價鍵將糖基單元添加到另一部分的普通方法。在第四方面，本專利技術因此提供化學改性包含至少一個硫醇基(-S-H)的蛋白質、肽或氨基酸的方法，所述方法包括(a)將所述硫醇基轉換為硒硫基(-S-Se-R2)；以及(b)使所述硒硫基與含硫醇基的有機化合物反應。以后分別將本專利技術第一、第二、第三和第四方面的方法稱為第一方法、第二方法、第三方法和第四方法。除非另有指明，本文中所有優選特征和定義涉及所有這些方法。此外，本專利技術包括本文所指的任何優選特征的任意和所有可能的組合，而不管本文是否具體披露這些組合。根據第一方法和第二方法，形成二硫鍵的概括性反應方案示于方案1中 Organic Moiety有機部分方案1優選地，方案1中顯示的有機部分是蛋白質、肽或氨基酸。根據第三方法和第四方法，將硒硫基引入蛋白質、肽或氨基酸中的概括性反應方案示于方案2中Q＝蛋白質、肽或氨基酸 方案2方案2的方法導致通過硒硫(-S-Se-)鍵將基團R2共價鍵合至蛋白質、肽或氨基酸。這種蛋白質、肽或氨基酸構成了本專利技術的另一特征。包含硒硫基的蛋白質和肽可用于通過X射線衍射技術確定蛋白質結構。目前，多波長異常分散(multiple wavelength anomalous dispersion，MAD)技術包括將蛋白質中的任何蛋氨酸殘基轉換為硒基蛋氨酸(selenomethionine)。然后比較改性蛋白質和未改性蛋白質的X射線衍射圖使得可確定未改性蛋白質的結構。本專利技術的方法使得可方便和容易地獲得可選擇的含硒的蛋白質或肽，所述含硒的蛋白質或肽可用于所述技術中。本專利技術的方法提供一種將重金屬引入蛋白質的容易方法，從而更容易解釋X射線衍射數據。如方案3所示，含硒硫的蛋白質、肽或氨基酸可進一步與概括性實施方案中所示的第四方法的含硫醇基的有機化合物反應，Q＝蛋白質、肽或氨基酸 方案3方案3的方法導致通過二硫鍵(-S-S-)將有機部分共價鍵合至蛋白質、肽或氨基酸。在該方法中，蛋白質、肽或氨基酸充當親電子試劑，而含硫醇基的有機化合物充當親核試劑。相反，利用glyco-MTS試劑的已知反應包括使蛋白質、肽或氨基酸中的親核硫醇基與親電子的glyco-MTS試劑反應。因此，本專利技術的方法利用glyco-MTS試劑對已知的蛋白質改性策略提供補充策略。如本文所使用的，烷基優選表示含有1-10個碳原子，優選含有1-6個碳原子的直鏈或支化的烷基。優選的烷基包括甲基和乙基。如本文所使用的，鏈烯基優選表示包括至少一個碳-碳雙鍵的直鏈或支化的烴基，且含有2-20個碳原子，優選2-10個碳原子，更優選2-6個碳原子。優選的鏈烯基包括-(CH2)CH＝CH2、-CH2CH2CH＝CH2、異戊二烯基((CH3)2C＝CHCH2-)和法呢基((CH3)2C＝CH2CH2-)。如本文所使用的，炔烴基優選表示包括至少一個碳-碳三鍵的直鏈或支化的烴基，且含有2-10個碳原子，優選2-6個碳原子。優選的炔烴基包括-CH本文檔來自技高網...

【技術保護點】
形成二硫鍵的方法，該方法包括：使包含至少一個硫醇基的有機化合物與通式Ⅰ的化合物反應，　　　　　Ｒ－Ｓ－Ｘ－Ｒ↑［１］　　Ⅰ　　　　其中：　　　　Ｘ表示ＳＯ↓［２］或Ｓｅ；　　　　Ｒ表示有機部分；和　　　　Ｒ↑［１］表示任選被取代的烷基、任選被取代的苯基、任選被取代的吡啶基或任選被取代的萘基；　　　　條件是，當Ｘ表示ＳＯ↓［２］時，Ｒ↑［１］不表示任選被取代的烷基。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：本杰明G戴維斯，戴維P甘布林，安東尼J費爾班克斯，菲利普加尼爾，
申請(專利權)人：艾西斯創新有限公司，
類型：發明
國別省市：GB[英國]