本發明專利技術涉及生物基因領域，具體涉及日本血吸蟲（中國大陸株）ＳｊＣＸＷＬ０６基因的基因序列、真核表達質粒ｐｃＤＮＡ３／ＳｊＣＸＷＬ０６的構建及重組質粒免疫小鼠的保護性效果觀察。ＳｊＣＸＷＬ０６基因全長８６１ｂｐ，開放閱讀框含３２７ｂｐ，編碼１０９個氨基酸。將ＳｊＣＸＷＬ０６基因亞克隆入真核表達載體ｐｃＤＮＡ３中，成功構建了重組質粒ｐｃＤＮＡ３／ＳｊＣＸＷＬ０６，制備ＤＮＡ疫苗免疫昆明系小鼠，獲得３１．７９％的減蟲率和３５．０２％的減卵率。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物基因領域，具體涉及日本血吸蟲中國大陸株SJCXWL06基因的基因序列及其在制備核酸疫苗上應用。
技術介紹
血吸蟲病是一種分布廣、危害嚴重的人畜共患寄生蟲病，其流行嚴重影響了人們群眾的身體健康并阻礙了疫區經濟的發展，是發展中國家包括中國在內的一個主要公共衛生問題。現階段血吸蟲病防治主要集中在藥物滅螺、化療和疫苗研究三個方面藥物滅螺是目前阻斷血吸蟲傳播最常用的措施，但由于大面積湖洲外灘滅螺受到生態和防洪等因素的限制，且財力耗費巨大而難以奏效；人畜同步化療雖可短期內緩解病情和疫情，但頻繁的化療已經導致血吸蟲對首選藥物吡喹酮產生了抗藥性，此藥的長期應用已面臨嚴峻挑戰；歷史經驗證明疫苗的研制并成功應用是控制和消滅一些重要傳染性疾病的最為經濟和有效的途徑之一。現階段處于研發中的血吸蟲疫苗主要有減毒活疫苗、重組蛋白疫苗和重組核酸疫苗，其中血吸蟲尾蚴減毒活疫苗由于數量來源十分有限，同時存在尾蚴毒力回復的安全性問題而難以推廣；重組蛋白疫苗制備過程繁瑣、人力物力花費較大而受到制約。因此，研制出安全有效、制備簡單、性能穩定且便于存儲運輸和方便使用的血吸蟲疫苗成了我們急需解決的問題。由于現代免疫學及分子生物學技術的迅速發展，我國在日本血吸蟲病疫苗的研制方面已取得顯著進展。我們的前期研究工作表明日本血吸蟲未成熟卵可溶性抗原(SIEA)具有明顯的抗雌蟲生殖產卵和抗蟲卵胚胎發育的作用，我們從SIEA中分離出SIEA26-28kDa天然分子抗原，已證明它是誘導宿主產生抗血吸蟲病保護性免疫力的主要組分，1999-2000年，衛生部專家組織進行了全國血吸蟲疫苗免疫保護統一檢測實驗，該亞單位分子疫苗(已申請專利技術專利，申請號CN200410023359.7)獲得了最佳的動物保護效果，其中減蟲率達53.9％，減卵率達89.3％。本專利技術利用該天然分子免疫的豬血清篩選日本血吸蟲中國大陸株尾蚴cDNA文庫，結果獲得日本血吸蟲新基因SJCWL06，我們對其進行基因克隆和免疫保護性效果的研究。
技術實現思路
本專利技術根據天然分子亞單位疫苗具有迄今為止最高的減卵率和減雌雄合抱率，利用該天然分子免疫的豬血清篩選日本血吸蟲中國大陸株尾蚴cDNA文庫，結果得到一種日本血吸蟲新基因SJCWL06，該基因全長861bp，有完整的閱讀框架，與蜜蜂SMC3蛋白編碼的mRNA基因序列同源性最高。本專利技術所要解決的技術問題在于公開了日本血吸蟲中國大陸株SJCWL06基因的序列。本專利技術公開的日本血吸蟲中國大陸株SJCWL06基因具有序列1所示的核苷酸序列和相應的序列2所示的氨基酸序列。序列1的第19個至第346個核苷酸區域為序列2的編碼區。本專利技術應用天然分子免疫豬血清篩選日本血吸蟲中國大陸株尾蚴cDNA文庫，經初篩和3輪復篩獲得8個陽性克隆。經PCR擴增及瓊脂糖平板電泳初步鑒定，8個陽性克隆全部擴增出特異性條帶，插入的cDNA分子片斷大小分布于0.6kb～3kb。利用NCBI網站的blast進行基因序列的同源性分析，結果表明8個陽性克隆中有一個日本血吸蟲新基因(即SJCWL06)。DNA序列分析表明該新基因的開放性閱讀框含有327bp，編碼109個氨基酸，理論分子量12.352kDa，理論等電點(pI)為4.9，有一個信號肽，多個磷酸化位點和一個ABC-三磷酸腺苷酶的結構域。本專利技術所要解決的另一技術問題在于公開上述日本血吸蟲中國大陸株SJCWL06基因在制備防治日本血吸蟲病重組疫苗中的應用。將SJCWL06基因亞克隆到真核表達質粒pcDNA3中，構建成重組質粒pcDNA3/SJCWL06，轉化DH5α細菌后擴大培養，制備純化的重組質粒DNA作為DNA疫苗免疫5-6周齡的昆明系小鼠，每次每只小鼠后腿肌肉注射重組質粒100μg。隔2周免疫1次，共3次。末次免疫后第3周以日本血吸蟲尾蚴進行攻擊感染，攻擊后第45天處死小鼠，心臟灌注法收集成蟲，肝臟用10％NaOH消化后計算每克肝組織蟲荷數(EPG)。結果發現pcDNA3/SJCWL06免疫小鼠獲得了31.79％的減蟲率和35.02％的減卵率。下面結合實例對本專利技術作進一步的說明。附圖說明圖1pcDNA3/SJCWL06重組質粒雙酶切鑒定1.pcDNA3/SJCWL06重組質粒Kpn I/Apa I酶雙酶切；2.SJCWL06 PCR產物 3.pcDNA3空白質粒Kpn I/Apa I酶雙酶切；4.pcDNA3空白質粒；5.DNA marker具體實施方式實施例一天然分子免疫豬血清篩選日本血吸蟲尾蚴cDNA文庫以及SJCWL06基因的克隆1.實驗材料1.1試驗血清天然分子疫苗免疫豬血清，由本實驗室(中南大學湘雅醫學院血吸蟲病研究室)制備，-20℃凍存備用。1.2細菌菌株大腸桿菌BM25.8和大腸桿菌XL1-Blue均由中南大學湘雅醫學院病原學實驗室保存。1.3文庫日本血吸蟲尾蚴cDNA文庫由南方醫科大學陳曉光教授構建、惠贈。該文庫采用CLONTECH的SMARTcDNA文庫構建試劑盒進行構建，將日本血吸蟲尾蚴cDNA定向克隆入λTriplEx2/BM25.8系統的sfiIA和sfiIB位點之間。文庫初級滴度為7.8×107pfu/ml，噬菌體重組率94％。1.4主要試劑胰蛋白胨、酵母提取物均購自OXOID公司；Ex Taq酶、dNTP、DNA-Marker、質粒DNA提取試劑盒均為大連寶生物公司產品；異丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)、瓊脂粉為上海生工公司產品；辣根過氧化物酶聯葡萄球A蛋白(HRP-SPA)購自上海科欣生物技術研究所；硝酸纖維素膜(NC膜)是臺州市路橋四甲生化塑料廠出品；溴化乙錠為Sigma公司產品，其他試劑均為國產分析純。2.方法2.1免疫豬血清的制備取本實驗室天然分子免疫豬血清按1∶50比例與大腸桿菌BM25.8裂解液混合，4℃吸附過夜，次日于4℃，12000rpm離心15分鐘取上清液，-20℃凍存備用，即可用于篩選cDNA文庫。2.2尾蚴cDNA文庫的篩選將cDNA文庫1∶10000稀釋，每5μL稀釋文庫加入200μL新鮮大腸桿菌XL1-Blue，鋪于固體培養上，37℃溫育至噬菌斑為針尖大小。覆以經10mM IPTG浸泡過的NC膜，繼續培養6小時后，定位揭膜，5％脫脂牛奶4℃封閉過夜，PBS洗滌3次，置1∶50致弱尾蚴免疫兔血清中，37℃、2小時洗滌后置于1∶150 HPR-SPA中，37℃，2小時，洗滌后DAB顯色。從平板上挑取三輪篩選持續陽性的噬菌斑，置200μL新鮮大腸桿菌BM25.8，400μL液體培養基混勻后，37℃振蕩1小時。取10μL上清液涂布于LB(A+)平板，37℃溫育12小時，挑取單菌落。按質粒DNA提取試劑盒說明提取質粒DNA。2.3PCR擴增與測序根據Primer Premier 4.10軟件依據質粒上的一段引物設計PCR引物H15’-CTCCGAGATCGGACGAGG-3’H25’-TAATACGATCACTATAGGG-3’PCR反應體系為10×Ex Taq buffer 10μL，2.5mM dNTP 8μL，5UExTaq酶1μL，25mM MgCL210μL，引物P1，P2各2μL，以1μL質粒DNA為模板。PCR程序94℃預變性5min，(94℃變本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種編碼日本血吸蟲ＳＪＣＸＷＬ０６基因的核苷酸序列，其特征在于它具有如下核苷酸序列：ｇｇｇｇｇａｇａｔｔｃａｇｃｔｇａｔａｔｇｃｇｔｇａｔａｔｇａａｔｃａａｔｔａｔｃｃｇｇｃｇｇａｃａａａａｇｔｃａｃｔｇ６０ ｇｔｔｇｃｔｔｔａａｃｔｃｔａａｔａｔｔｔｇｃｔａｔｔｃａａａａａｔｇｔｇａｔｃｃａｇｃａｃｃａｔｔｃｔａｔｔｔａｔｔｔ１２０ｇａｔｇａａａｔｔｇａｔｇｃｃｇｃｔｔｔａｇａｔｇｃｔｃａａｔ ａｔｃｇｔａａａｇｃｃｇｔａｇｃａｇａｔａｔｇａｔｔｃｇａ１８０ｇａｔｔｔａａａｇｔｃｇｇａａｇｃｔｃａａｔｔｔａｔｔａｃｇａｃａａｃａｔｔｔａｇａｃｃａｇａｇｔｔｇｔｔｇｇａａｔｃｃ２４０ ｇｃｔｇａａａａａｔｔｃｔａｃｇｇｔｇｔａａａｇｔｔｔｃｇｔａａｔａａａｇｔｔａｇｔｃａｃａｔｔｇａａｔｇｃｇｔａａｃｔ３００ａａａｇｇｔｇａａｇｃａｃｔｔｇａｔｔｔｔｇｔａｇａａｇａｔｇａｔｃ ａａａｃａｃａｔｇｇａｔａａｔｇａｔｇａｔａａｃａｃ３６０ｔｇａｔａａｔａａｔｃｔｔｔｔｔａｔａａｃａｃａｔａｃｃｔａｔｔｇｔｔｃｔｔａａｔｔａｃｔｃｔｔａｃｔｃｔｔａｔｔｔｃａ４２０ｔａ ｔｔｔａｃａｃａｔｔｃａｔｃｔａｔｇｃａｔａｔｔｔｔｇｔａｔａｔａｔｃａｔｃａｔｔａｔｃａａｃａｔａｃａｔｔｃａｔｃ４８０ａａｔａａｔｃｔａａａｔｇａａｔａａａａａａｔｔｔｃｃａｇａａｔｔｔｔｃｔ ｇｔａａａｔｔｃｃｃａｔｔｃｔａｔｔａｔｃａｔ５４０ｃａｇａｔｔａｔｔｇｔｔｇｔｃａｔｔｔｔｃｇｔａａａａｔｇａｔｃａｔｔａｃｃａａｔｃａａｔｇｔｔａｇｃａｔｔｔａｃａｃａ６００ａｔｔａｇ ａａａｔｔｃｔａｔｔｃｇｔｇｔａａａａｔａａｔｔｃａｔｇａｔａａｔｔｇａａｔｇｔｇｔａｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔａｃ６６０ａｇｔｔｔｃｔａａｔｇａｔｔｔａｇｇａｔａａｔｔｔｔｇｔｔｔａｔｔｇａａｔａｔｔ ｃｃａａｔｃｔａｔｔｔｇｔｃｔｃｔａｔｔ７２０ｔｇｔａｔｔｃａｔｔｔｃｔｔｃｔｔｃｇｔｔｔｔａｔｔｇｇｇｔｔｔｔａｃａｃｔｔｔ...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：曾少華，汪世平，呂志躍，張加詳，周松華，劉雪琴，
申請(專利權)人：汪世平，曾少華，
類型：發明
國別省市：43[中國|湖南]
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