通過使用閉合吸管玻璃化方法低溫貯藏人胚泡來源的干細胞技術

用于生物學細胞，特別是胚泡來源的干細胞（ＢＳ細胞）玻璃化的改進方法。所述方法對在解凍后保持生活力的細胞非常溫和。所述方法包括，ｉ）將細胞轉移至第一種溶液（溶液Ａ）中，ｉｉ）任選地在第一種溶液中溫育所述細胞，ｉｉｉ）將步驟ｉ）或ｉｉ）中獲得的細胞轉移至第二種溶液（溶液Ｂ）中，ｉｖ）任選地在第二種溶液中溫育所述細胞，ｖ）將從步驟ｉｉｉ）或ｉｖ）中獲得的細胞轉移至一個或多個具有允許可在其中包含至少２０μｌ體積大小的閉合吸管，ｖｉ）封閉所述一個或多個閉合吸管，和ｖｉｉ）玻璃化一個或多個閉合吸管。本發明專利技術的重要特征在使用閉合吸管以及可被有效地玻璃化和隨后被解凍的相對較大的體積。（*該技術在2024年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及用于玻璃化生物學細胞，特別是胚泡來源的干細胞(BS細胞)的改進方法。所述方法對解凍后仍保持活性的細胞是非常溫和的。
技術介紹
干細胞是具有自我更新和產生特化或分化細胞之獨特能力的細胞類型。盡管絕大部分體細胞，例如心臟細胞或皮膚細胞，負責行使特定功能，但干細胞在其接收到發育成特定細胞類型的信號之前功能未定。形成所述干細胞獨特性的是其增殖能力以及其發生分化的能力。多年來，研究人員致力于尋找使用干細胞替代受損或病變的細胞和組織的方法。目前，大部分研究集中于兩種類型的干細胞，胚胎干細胞和體細胞干細胞。胚胎干細胞來源于胚胎植入前的受精卵母細胞，即胚泡，而所述體細胞干細胞存在于成熟生物體中，例如骨髓、表皮和腸內。根據許多歐洲和其它國家的國家法律，受精卵在植入子宮前即受精后10-14天并不被認為是胚胎，因此當如本專利技術應用時，這類細胞在此處被稱為胚泡來源的干細胞或hBS細胞。多能性檢驗已顯示盡管所述胚胎或胚泡來源的干細胞可產生生物體內的所有細胞，包括生殖細胞，但體細胞干細胞具有更有限的衍生細胞類型集庫。1998年，研究人員第一次能從人受精卵母細胞中分離出胚胎干細胞并將其培養在培養基中，參見例如美國專利5843780和美國專利6200806。在干細胞
中越來越多的研究和進展需要獲得適合于保存所述細胞和細胞系的方法。細胞可通過玻璃化或冷凍貯藏。由于細胞外冰的形成具有破壞作用，因此使用常規方法的低溫貯藏很難應用于復雜和敏感的生物學材料。經過玻璃化過程，含有所述細胞的樣品被快速冷卻至極低的溫度，水容物不結晶而形成的玻璃樣態。因此，玻璃化是在無冰晶形成的情況下快速冷凍液體介質的方法。無定形玻璃在直接將例如含有細胞的吸管放入液氮中的快速冷凍過程中形成。所述玻璃保持液體的正常分布但以過冷卻的形式保存。所述玻璃避免了冰晶并且所述細胞免受與冰晶形成相關的細胞損害。因此，將玻璃化定義為避免晶核形成和生長的無定形玻璃樣態的固化。曾經對人胚胎干細胞低溫貯藏進行研究并且Reubinoff等人(Human Reproduction，2001，16，2187-2194)描述了通過使用開口抽拉式吸管玻璃化方法進行低溫貯藏這些細胞的方法。所述方法的缺點是其涉及到吸管的開口端與液氮接觸，這可能會成為將要被玻璃化的生物材料的污染源。此外，由于抽拉吸管的大小，Reubinoff等人進行玻璃化的體積約為1μl。用于避免與氮直接接觸的玻璃化方法已在Lopez-Bejar等人(Theriogenology，2002，581541-52)對兔胚胎和Chen等人(HumanReproduction，2001，16(11)2350-56)對小鼠卵母細胞的應用中得以描述。這些方法都使用了與已知的開口抽拉吸管相同的抽拉方式并因此而擁有與Reubinoff等人使用的抽拉吸管具有相同大小的封閉抽拉吸管。因此，在這些方法中，各吸管中玻璃化的體積約都為1-2μl。慢速冷凍和快速解凍方法曾用來低溫貯藏細胞系。盡管這些方法適合用來低溫貯藏例如小鼠胚胎干細胞，但對于未分化的人胚胎干細胞的存活率似乎很低，而且絕大部分所述細胞分化或死亡。通常，用這種慢速冷凍方法玻璃化較大體積的細胞會導致較低的恢復率(Reubinoff等人)。因此，仍就需要發展易于操作、涉及盡可能少的步驟而同時在所述過程中避免或至少減少對所述細胞不想要的污染之風險的有效玻璃化方法。特別地，需要發展用于細胞或細胞系(例如hBS或hBS細胞系)的較大體積玻璃化的有效方法。專利技術描述如上所述，有效的低溫貯藏方法是胚泡來源的干細胞系產生和廣泛應用、并在此之下建立人胚泡干細胞庫所必須的。有效的冷凍和解凍技術能夠有效地保存細胞和細胞系。為了一些目的，希望在每一根吸管中進行大體積玻璃化。例如當在給定的步驟(或應用)中需要大量的細胞或當細胞將以其玻璃化狀態通過郵寄進行派送時就是這種情況。本專利技術涉及用于細胞玻璃化的方法，包括i)將細胞轉移至第一種溶液(溶液A)中，ii)任選地在第一種溶液中溫育所述細胞，iii)將步驟i)或ii)中獲得的細胞轉移至第二種溶液(溶液B)中，iv)任選地在第二種溶液中溫育所述細胞，v)將從步驟iii)或iv)中獲得的細胞轉移至一個或多個具有允許可在其中包含至少20μl體積大小的閉合吸管，vi)封閉所述一個或多個閉合吸管，和vii)玻璃化一個或多個閉合吸管。上述方法的一個非常重要的特征是每一吸管中可被玻璃化的大體積。本專利技術涉及用于玻璃化閉合吸管中的細胞的方法，所述閉合吸管具有允許在其中容納從約20μl至約250μl，例如從約20μl至約225μl，從約25μl至約200μl，從約25μl至約175μl，從約25μl至約150μl，從約30μl至約125μl，從約30μl至約100μl，從約35μl至約75μl，從約40μl至約50μl體積的大小。在本專利技術提供的實施例中使用的吸管長度約為13cm，直徑約為2mm和約為0.1mm厚的非常薄的塑料管壁(閉合吸管，French迷你吸管，250μl，L’Aigle，IMV ZA 475°，133mm，Svensk Mjlk)。然而，可以想象假設裝液氮的容器的大小允許液氮淹沒整個吸管的長度，只要吸管的直徑和厚度幾乎與此處所使用的吸管一樣，那么使用更長的吸管就可成功地玻璃化甚至更大的體積。另一個上述方法中非常重要的步驟是使用所謂的閉合吸管。在本上下文中，術語“閉合吸管”用來指在裝填位置具有能使例如在合適培養基中的生物學物質(例如細胞或細胞系)裝入的開口端的吸管，但在裝入后立即緊密封閉該末端以避免來自周圍不想要的細胞污染并且也避免不想要的來自細胞的周邊污染的風險。吸管兩端的氣密性封閉對防止樣品和環境的污染非常重要。來自Cryo Bio System稱為CBSSYMS的手工封閉單元是一種合適的系統。在所述吸管的一邊開口而在另一邊裝有塞子是非常重要的。該塞子允許用注射器吸入空氣以使吸管充入液體，但一旦其與液體直接接觸則聚合化，在該端封閉毛細管。也可以使用封閉該端的其它合適方法。然后使用密封物(焊接、粘合等)封閉另一端。重要的是壁要薄并且直徑要小，以使吸管中的內含物快速冷卻。吸管長度并不是太關鍵，但為實際需要，其長度最好是標準長度，以適合液氮灌中的標準支架。所述吸管由塑料制得，但也可由任何合適的材料包括玻璃(盡管其可能更容易斷裂)制得。重要的是所述材料要安全并且不吸收或釋放物質，其是無孔、無毒和生物相容性的。在本專利技術應用中，術語“低溫貯藏”是指在極端低的溫度下保存生物學材料。在本專利技術上下文中所使用的術語“直接接觸”或“直接暴露于”是指如果生物學材料或所述材料所存在的培養基、溶液或材料的表面與冷凍材料接觸時，稱生物學材料“直接接觸”或“直接暴露”于例如冷凍材料。本專利技術上下文中所使用的術語“冷凍材料”，是指任何能夠造成生物學材料玻璃化的材料。因為樣品不直接與冷凍材料接觸，理論上可使用任何足夠冷的冷凍介質。合適的材料包括但不限于液態氣體例如液氮、液態丙烷、液氦、乙烷等。此處所使用的“生活力”是指在一段時間內生物學材料能夠正常生存、發育和增殖。根據本專利技術，將至少20μl體積的生物學材料(例如hBS細胞或hBS細胞系)置于閉合吸管中。然后將所述閉合吸管暴露于冷凍本文檔來自技高網...

【技術保護點】
用于細胞玻璃化的方法，包括　　　　ｉ）將細胞轉移至第一種溶液（溶液Ａ）中，　　　　ｉｉ）任選地在第一種溶液中溫育所述細胞，　　　　ｉｉｉ）將步驟ｉ）或ｉｉ）中獲得的所述細胞轉移至第二種溶液（溶液Ｂ）中，　　　　ｉｖ）任選地在第二種溶液中溫育所述細胞，　　　　ｖ）將從步驟ｉｉｉ）或ｉｖ）中獲得的所述細胞轉移至一個或多個具有允許可在其中包含至少２０μｌ體積大小的閉合吸管，　　　　ｖｉ）封閉所述一個或多個閉合吸管，和　　　　ｖｉｉ）玻璃化一個或多個閉合吸管。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：A舍格倫，E舍格倫詹森，S埃內巴克，P埃里克森，
申請(專利權)人：塞拉提斯股份公司，
類型：發明
國別省市：SE[瑞典]