用于基因表達的核酸構建體制造技術

本發明專利技術提供了含有病毒基因組核酸的核酸構建體，其含有至少兩個內源基因表達調控單元，每個該內源基因表達調控單元均包含內源啟動子，其中該單元的內源啟動子在病毒基因組核酸來源病毒的病毒生活周期中的相同階段具有活性。該內源基因表達調控單元用于表達所選的特定異源編碼基因以及特別用于表達異源抗原。可將構建體用在疫苗中以產生對異源抗原的免疫應答以及特別可用于ＤＮＡ疫苗中。本發明專利技術還提供產生構建體的方法以及其施用方式。（*該技術在2023年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及分子生物學和免疫學領域，并主要涉及基因表達的方法。更具體地，本專利技術涉及用于表達多肽的核酸構建體，以及它們在通過免疫尤其是通過核酸免疫而在受試者中激發免疫應答中的應用。
技術介紹
傳統的接種疫苗策略通常包括施用“活的”或“死的”疫苗(Ertl等，(1996)J.Immunol.1563579～3582)。所謂的活疫苗包括減毒微生物和基于活載體的重組分子。死疫苗包括那些基于滅活的完整病原體和亞單位疫苗的疫苗，所述亞單位疫苗例如可溶性的病原體亞單位或蛋白質亞單位。活疫苗通常能在免疫個體中成功地提供有效的免疫應答；然而，這種疫苗在免疫缺乏的或懷孕的受試者中是危險的，其可能回復為致病性有機體，或可能被其它的病原體污染(Hassett等，(1996)Trends inMicrobiol.8307～312)。死疫苗，如亞單位疫苗，避免了與活疫苗有關的安全問題。由于亞單位疫苗不含有完整病原體，所以它們通常能避免免疫調節性病毒蛋白的問題，所述免疫調節性病毒蛋白可從減毒病毒疫苗表達并能降低疫苗接種的效率。然而，死疫苗，尤其是亞單位疫苗，經常不能在免疫個體中提供合適的和/或有效的免疫應答。增強亞單位疫苗的效率的一個可能的方法是，使疫苗包含多個亞單位。用多個抗原進行免疫接種是理想的，因為該方法通常誘導更顯著的免疫應答，其能提供比用單個抗原進行免疫接種更好的保護。多個亞單位疫苗也有助于減少鑒定能提供保護性應答的特定單個抗原的需要。這對于在遠交群體中誘導細胞免疫應答尤其重要，遠交群體中的個體對單個基因產物的應答差異很大，因此，沒有一個抗原能在該整個群體中引起保護性的免疫應答。可通過很多途徑將疫苗導入到待免疫的受試者中。最近，已經描述了通過肌肉內(Wolff等，(1990)Science 24714651468)或使用針和注射器的皮內注射(Raz等，(1994)PNAS USA 919519～9523)來直接注射質粒DNA。從而，編碼抗原的構建體，而不是抗原本身，被導入到受試者中。這種包含編碼抗原的核酸構建體的疫苗稱作DNA疫苗。遞送DNA疫苗的另一種方法稱作彈道式或顆粒介導的DNA遞送，其使用無針顆粒遞送裝置把DNA包被的微金珠直接施用到表皮細胞中(Yang等，(1990)PNAS USA 879568～9572)。因此，很多遞送技術可用于遞送免疫接種中使用的核酸，包括將核酸包被的微粒遞送到靶組織中的顆粒介導的技術(參見，例如共同擁有的美國專利No.5,865,796，1999年2月2日出版)。使用DNA疫苗獲得的有效保護水平，與傳統蛋白質亞單位疫苗和滅活或減毒病毒疫苗激發的有效保護水平類似；盡管它通常比在自然感染恢復后的康復期動物中觀察到的低(Manickan等，(1997)CriticalReview Immunol.17139～154)。顆粒介導的核酸免疫技術已經顯示在表皮遞送納克量的DNA后，能激發體液和細胞毒性T淋巴細胞免疫應答(Pertmer等，(1995)Vaccine 131427～1430)。已將這種顆粒介導的遞送技術與其它類型的核酸接種進行了比較，并發現了顯著的優勢。Fynan等，(1995)Iht.J.Immunopharmacology 1779～83，Fynan等，(1993)Proc.Natl.Acad.SCI.USA 9011478～11482，和Raz等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 919519～9523。
技術實現思路
本專利技術是基于以下事實病毒基因組中的基因群以使基因表達間的干擾最小化而使含有這些基因的區域的穩定性最大化的方式共同進化。病毒基因的這種協同進化可用于產生用于異源編碼序列共表達的表達構建體。因此，獲取包含兩個或多個這種病毒基因的基因組核酸區域，而且用待表達的異源編碼序列取代病毒基因的天然編碼序列。因此，構建體受益于使用的病毒啟動子與其它調控元件的相容性，并因此顯示增強的穩定性和最小的干擾。然后可以引入對基因組核酸的進一步改變以使構建體最佳化。因此，本專利技術提供了能表達多個異源編碼序列的構建體。使用單個構建體來表達幾個異源多肽，而不是從單獨的構建體來表達每個異源多肽，能降低制備和質量控制的復雜性。它還可能降低獲得調控認可的難度。由于使用了病毒基因組核酸的內源基因表達調控單元，所以增加了該構建體的穩定性并降低了干擾，這與把帶有它們自身的啟動子或通常用于獲得高水平表達的其它啟動子的多個基因插入到載體中而構建的構建體明顯不同，因為后者所述的構建體常顯示不穩定性以及啟動子間的干擾。因此，本專利技術提供了含有病毒基因組核酸的核酸構建體，所述病毒基因組核酸含有至少兩個內源基因表達調控單元，每個該內源基因表達調控單元均包含內源啟動子，其中該單元的內源啟動子在病毒基因組核酸來源病毒的病毒生活周期中的相同階段具有活性，其中(a)至少兩個含有在相同階段具有活性的啟動子的內源基因表達調控單元中的每個均可操作地連接于插入到病毒基因組核酸中的分離的異源編碼序列上；而且(b)除了插入到其中的異源序列外，病毒基因組核酸的長度為1kb到50kb。本專利技術還提供了產生核酸構建體的方法，該核酸構建體用于直接施用于受試者以在受試者中激發免疫應答，所述方法包括(a)將病毒基因組核酸插入到載體骨架中，所述病毒基因組核酸含有至少兩個內源基因表達調控單元，每個該內源基因表達調控單元均包含內源啟動子，其中該單元的內源啟動子在病毒基因組核酸來源病毒的病毒周期中的相同階段具有活性；而且(b)在將病毒基因組核酸插入到載體骨架中之前、同時或之后，將病毒基因組核酸中的至少兩個內源基因表達調控單元的內源啟動子可操作地連接到異源編碼序列上。其中，除了插入到其中的異源序列外，病毒基因組核酸的長度為1kb到50kb。本專利技術還提供了適于由顆粒介導的遞送裝置進行遞送的包被的顆粒，該顆粒包含由核酸構建體包被的載體顆粒，其中，所述構建體包含病毒基因組核酸，該病毒基因組核酸含有至少兩個內源基因表達調控單元，每個該內源基因表達調控單元均包含內源啟動子，其中該單元的內源啟動子在病毒基因組核酸來源病毒的病毒周期中的相同階段具有活性，其中(a)至少兩個含有啟動子的內源基因表達調控單元中的每個均可操作地連接于插入到病毒基因組核酸中的異源編碼序列上；而且(b)除了插入到其中的異源序列外，病毒基因組核酸的長度為1kb到50kb。本專利技術還提供-一種用于顆粒介導的遞送裝置的劑量容器，該劑量容器包含本專利技術的包被的顆粒；和-一種顆粒介導的遞送裝置，該顆粒介導的遞送裝置裝載有本專利技術的包被的顆粒。在另一個實施方案中，本專利技術還提供了感興趣的多肽在哺乳動物細胞中獲得表達的方法，該方法包括將含有病毒基因組核酸的核酸構建體轉移到所述細胞中，所述的病毒基因組核酸含有至少兩個內源基因表達調控單元，每個該內源基因表達調控單元均包含內源啟動子，其中該單元的內源啟動子在病毒基因組核酸來源病毒的病毒周期中的相同階段具有活性，其中-至少兩個含有啟動子的內源基因表達調控單元中的每個均可操作地連接于插入到病毒基因組核酸中的異源編碼序列上；而且-除了插入到其中的異源序列外，病毒基因組核酸的長度為1kb到50kb。在另一個實施方案中，本專利技術提供了一種核酸免疫的方法，該方本文檔來自技高網...

【技術保護點】
含有病毒基因組核酸的核酸構建體，所述病毒基因組核酸含有至少兩個內源基因表達調控單元，每個該內源基因表達調控單元均包含內源啟動子，其中該單元的內源啟動子在病毒基因組核酸來源病毒的病毒生活周期中的相同階段具有活性，其中：（ａ）含有在相同階段有活性的啟動子的至少兩個內源基因表達調控單元中的每個均可操作地連接于插入到病毒基因組核酸中的分離的異源編碼序列上；和（ｂ）除了插入到其中的異源序列外，病毒基因組核酸的長度為１ｋｂ到５０ｋｂ。

【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：拉爾夫帕特里克布朗，
申請(專利權)人：磨粉機械研究有限公司，
類型：發明
國別省市：GB[英國]