含有異源核和線粒體的多能細胞制造技術

提供如下的異源嵌合ＥＳ細胞，其含有來自一個物種的一個個體的核和來自相同物種的不同個體的線粒體。ＥＳ細胞可用于分化為分化的細胞型，用于治療，或研究在形成胚胎和分化中的不同發育過程。（*該技術在2021年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術的領域是對細胞的操作，以產生用于核移植方法的非人類卵母細胞，其中這些核移植單位含有來自相同種的兩個不同細胞來源的異源核和線粒體。
技術介紹
已經證實能將分化細胞的核移植到去核成熟(term)細胞中，產生去分化的多能細胞，這為生物學操作、研究和治療提供了廣泛的機會。應用能替代或補充生物缺陷或不利醫學病癥的細胞或器官糾正這些缺陷或病癥的機會越來越多。至于移植，迄今仍依賴于從供體獲得的器官，其中供體已經死亡，或者供體有兩份器官而放棄其中一份。盡管積極鼓勵人們在死后提供可以使用的器官，但是可以利用的器官仍然極其短缺，許多人排隊等待。在替換缺陷器官失敗可能致命的情況下，找到替代器官的時間十分有限。不僅器官供應短缺，而且供體必須與受體組織相容。甚至在供體與受體之間有緊密的組織相容性匹配時，受體通常也必須依賴免疫抑制藥物防止移植物排斥。這些藥物對移植受體通常有嚴重的副作用，但是必須忍受，因為沒有移植物將是致命的。由于手術能力已經擴展，細胞和器官移植物糾正大量適應證的可能性越來越大。胚胎干(“ES”)細胞提供了按照需要生產分化細胞、器官和完整個體的機會，使人們可以克隆特定基因型。至于家畜，例如有蹄類動物，來自著床前家畜胚胎的核支持去核卵母細胞發育成熟(Smith等人，Biol Reprod.401027-1035(1989)；Keefer等人，同上50935-939(1994))。由于ES細胞的意義和重要性，有大量論文報道了該技術的不同方面。例如，Notarianni等人，J.Reprod.Fert.Suppl.43255-260(1991)報道了來自豬和綿羊胚泡的穩定的多能細胞系的建立；Gerfen等人，Anim.Biotech.61-14(1995)報道了從豬胚泡中分離胚胎細胞系，這些細胞在培養過程中分化為幾種不同的細胞型；Cherny等人，Theriogenology 41175(1994)報道了長期培養保存的多能牛原始生殖細胞衍生的細胞系，它們形成胚狀體并自發分化為至少兩種不同的細胞型；Campbell等人，Nature 38064-68(1996)報道了在有利于分離小鼠中的ES細胞系的條件下培養綿羊胚胎，在第9天對胚胎的胚盤(“ED”)細胞進行核移植，產生活的羊羔；VanStekelenburg-Hamers等人，Mol.Reprod.Dev.40444-454(1995)報道了從牛胚泡的內細胞團(“ICM”)細胞中分離并表征永久細胞系；Smith等人，WO 94/24274，1994年10月7日公布，Wheeler等人，WO94/26889，1994年11月24日公布，報道了可用于生產轉基因動物的牛和豬多能ES細胞的產生；Collas等人，Mol.Reprod.Dev.38264-267(1994)報道了通過向去核成熟卵母細胞中顯微注射裂解的供體細胞，對牛ICM進行核移植(參見，Keefer等人，同上文)；Sims等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906143-6147(1993)報道了通過將體外短期培養的牛ICM細胞的核移植到去核成熟卵母細胞中，生產小牛(參見，Stice等人，Biol.Reprod.54100-110(1996))。最后，Robl等人的PCT/US97/12919報道了由種間核移植產生的ES細胞。ES細胞操作提供的特殊機會保證了對ES細胞的特性、它們可來自的來源、它們增殖和成熟的方式等的持續研究和改進。因此，十分關注尋找在細胞和器官或器官片段發育中廣泛使用ES細胞的方法，用于移植、動物飼養、研究導致細胞分化和類器官、器官及其部分形成的發育過程。專利技術概述提供如下的方法和組合物，它們涉及能夠培養增殖并分化為不同細胞型的修飾卵母細胞和ES細胞，工程化ES細胞，由其產生的分化細胞，器官或其部分和由之產生的生物。該方法包括使用異源卵細胞，其中異源是指用于細胞的最終物種(這些細胞去核并導入入異種核)產生含有來自一個種的細胞質和線粒體和來自不同種的核的嵌合細胞。在嵌合細胞增殖獲得可產生ES細胞的核移植(NT)單位后，ES細胞可用于進一步增殖和科學研究，或者可將NT單位移植到異源、同源或其它相容的異種宿主子宮中(基于原始卵母細胞)以備妊娠和分娩。然后可以收獲來自該F1動物的卵母細胞，去核，導入異源核，產生一種卵細胞，該細胞能產生含有單一物種的蛋白質、有免疫能力的細胞，在植入異體宿主時排斥危險降低，因而能夠接受。對于本申請，這些細胞及其后代被稱為“異源嵌合的”(allochimeric)。特別關注將要施用分化異源嵌合細胞的宿主的核的用途。具體實施方案描述提供了如下的異源嵌合細胞，其含有來自第一個物種的第一個個體的線粒體和來自相同物種的第二個個體的核。一般來說，將產生能發育成胚胎或大量不同細胞型的多能細胞，其含有來自異源物種的線粒體(異源物種是指目的種)，和異種的核(異種是指將要植入細胞的物種，或與細胞植入和細胞分化為胚胎相容的不同物種)。發育或成熟的胚胎然后可用于收獲卵母細胞，使卵母細胞去核，并導入來自相同物種的核作為線粒體。產生的異源嵌合細胞可以在體外和體內用于研究分化，用于產生不同分化途徑(例如外胚層、內胚層或中胚層)的細胞，和這些類別的細胞，如神經元細胞、神經元、星形細胞、神經膠質細胞、神經節等，造血細胞，例如淋巴細胞、巨噬細胞、NK細胞、紅細胞、巨核細胞等，成纖維細胞、成肌細胞等。該方法包括下列主要步驟1.收獲卵細胞并去核。2.將來自不同于該卵細胞的物種的核線粒體基因導入不同物種的體細胞的核基因組中。3.將來自不同于該卵細胞的物種的核導入去核卵細胞中，產生嵌合細胞。4.擴增嵌合細胞，產生活性(competent)嵌合ES細胞，或者溫育以發育核移植(NT)單位。5.將活性嵌合NT單位植入到相容的雌性宿主中。6.使嵌合NT單位生長為胚胎或至足月，產生新生動物。7.使新生動物生長到一定年齡，產生嵌合卵母細胞。8.從后代中收獲嵌合卵母細胞。9.將嵌合卵母細胞去核，導入與卵母細胞線粒體異源的核，產生異源嵌合NT單位。10.培養異源嵌合NT單位產生ES細胞。11.任選地遺傳修飾異源嵌合ES細胞。12.利用異源嵌合ES細胞生產其它細胞型。現在將詳述該方法的每一個步驟。1.收獲卵細胞并去核。卵細胞可從任何常規目的宿主中收獲，希望含有來自目的物種的線粒體。因此，任何目的哺乳動物種都可用作卵細胞的來源，特別是家畜，更特別地是大型家畜，例如馬、牛、綿羊、豬、貓、犬、兔、鼠等，和靈長類動物，例如人、猴和猿。卵母細胞可以用任何常規方法獲得，取決于卵泡的來源是宰殺動物還是需要手術方法。特別關注的是靈長類動物細胞，更特別地是人類細胞，它們可用于產生分化的細胞。這些細胞可來自這些物種的任一成員，隨后使用的核將決定物種和細胞的組織相容性。本專利技術尤其使用人類細胞，盡管也有異源嵌合細胞能起作用的其它物種的例子，例如珍稀動物、體外受精不可行的動物等。人類細胞已經分離并去核。在Zhang等人，J.Assist.Reprod.Genet.12361-8(1995)中，分離并凍存人類胎卵，在融解后發現能成熟形成極體。Messinis等人，Br.J.Obstet.Gynaecol.9339-42(1本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種生產異源嵌合細胞的方法，其含有來自第一個人的線粒體和來自第二個不同的人的核，該方法包括：將來自第一個人的卵母細胞去核；將來自非人類的物種的核導入該去核卵母細胞中，產生第一種嵌合卵母細胞；培養擴增第一種嵌合細胞，產 生ＮＴ單位；將該ＥＳ細胞植入相容的雌性宿主中，使該ＮＴ單位生長為至少一個含有第二種嵌合卵母細胞的胚胎；收集并分離至少一個第二種嵌合卵母細胞；將至少一個第二種嵌合卵母細胞去核，并將人的核導入該第二種嵌合卵母細胞中，產生 異源嵌合ＮＴ單位；和培養該異源嵌合ＮＴ單位，產生異源嵌合ＥＳ細胞。

【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：MD威斯特，
申請(專利權)人：先進細胞技術公司，
類型：發明
國別省市：US[美國]