不依賴飼養細胞的人胚干細胞培養基制造技術

本發明專利技術涉及一種不依賴飼養細胞的人胚干細胞培養基（ＬＤ－１細胞培養基），具體涉及在普通人胚干細胞培養基中加入了支持人胚干細胞自我更新的一些生長因子，并且不依賴鼠胚成纖維細胞或其他任何細胞的人胚干細胞培養基。所述生長因子是纖維生長因子２（ｂＦＧＦ）、Ｎｏｇｇｉｎ等。將這些因子添加到普通人胚干細胞培養基中后，可使其直接用于培養人胚干細胞，而不再需要補充來自鼠胚成纖維細胞或其他任何細胞的任何成份。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種不依賴飼養細胞的人胚干細胞培養基(LD1細胞培養基)，具體涉及在普通人胚干細胞培養基中加入了一些支持人胚干細胞自我更新的因子，并且不依賴鼠胚成纖維細胞或其他任何細胞的人胚干細胞培養基。
技術介紹
1998年美國威斯康星大學Thomson教授首次成功地將早期人胚胎(受精后5-7天的囊胚)中最原始未分化的內細胞群(Inner Cell Mass，ICM)分離出來、接種到呈單層培養的鼠胚成纖維細胞上(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)，持續體外培養、傳代，且保持其未分化的狀態，并稱之為人體胚胎干細胞(以下簡稱為人胚干細胞或hES細胞)(Thomson JA，Itskovitz-E1dor J，Shapiro SS，Waknitz MA，Swiergiel JJ，MarshallVS，Jones JM.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.Science.1998 Nov 6；282(5391)1145-7.)。根據胚胎學研究，人體所有的組織、器官都是由這些ICM分化形成的，ICM被認為具有全能性(Totipotency)。因此，hES細胞很可能帶來21世紀醫學革命。hES細胞研究的目的最終是用于臨床治療患者，但目前國際上現有的hES細胞系，在分離和培養的過程中，均需要鼠胚成纖維細胞作為支持細胞，因而可能含有動物的某種未知的有害成分，如動物病毒等。這樣的hES細胞顯然不適于臨床應用，因為將如此培養的hES細胞移植到患者體內，就有可能把某種未知的動物病毒或其它有害物質帶給人類。此外，鼠胚成纖維細胞(MEFs)的制備不僅耗時、成本高、且受到多個環節不穩定因素的影響，含有MEFs成分的hES細胞培養基成分均不恒定。這給hES細胞實驗研究帶來很多困難與不便，例如重復性不好等。因此，建立不依賴鼠胚成纖維細胞的hES細胞系是本領域需解決的重大課題。為解決此問題，研究人員們試圖避免將hES細胞接種到鼠胚成纖維細胞上的方法進行培養，如2001年Xu等人用條件培養基(即在MEFs上過夜而獲取了其有效因子的普通hES培養基)，培養接種在Matrigel上的hES細胞，獲得成功(Xu C，Inokuma MS，Denham J，Golds K，Kundu P，Gold JD，Carpenter MK.Feeder-free growth of undifferentiatedhuman embryonic stem cells.Nat Biotechnol.2001 Oct；19(10)971-4.)。這樣，實際上是將hES細胞與MEFs的關系由直接接觸變為間接接觸，并未真正完全擺脫對MEFs的依賴。根據研究，MEFs不僅有助于hES細胞貼壁生長，更重要的是MEFs含有某種(些)未知的物質，支持了hES細胞的自我更新。人們推測，鼠胚成纖維細胞中可能分泌了某種(些)營養因子或代謝產物而使hES細胞系進行自我更新。從理論上說，如果能搞清楚這些營養因子是什么物質，或者找到具有同等生物效應的營養因子，把它(們)添加到普通hES細胞培養基中，hES細胞的培養就能徹底擺脫對MEFs的依賴。但目前未見到此類工作成功的有關報道。
技術實現思路
本專利技術的目的是找到不依賴鼠胚成纖維細胞(MEFs)，也不添加任何其他飼養細胞成分，并能維持人胚干細胞(hES)細胞進行自我更新的物質；本專利技術的另一目的是提供一種新型的不依賴鼠胚成纖維細胞或其他任何細胞成分的人胚干細胞培養基。本專利技術發現了一些支持hES細胞生長作用的生長因子，將這些因子按照一定的濃度添加到普通hES細胞培養基中后，可使其直接用于培養人胚干細胞，而不再需要補充來自鼠胚成纖維細胞或其他任何細胞的任何成份。用本專利技術發現的生長因子配制的人胚干細胞培養基，不依賴鼠胚成纖維細胞或其他任何細胞，達到了本專利技術目的。本專利技術發現的支持hES細胞生長的因子是bFGF(纖維生長因子2)和Noggin(如可用Recombinant Mouse Noggin/Fc Chimera等)。本專利技術提供的人胚干細胞培養基(LD-1細胞培養基)是在普通hES細胞培養基中加入超常濃度的bFGF和Noggin。在本專利技術提供的人胚干細胞培養基中，bFGF和Noggin的使用濃度是很重要的。本專利技術人經過多次探索，才找到了合適的bFGF和Noggin使用濃度，即bFGF4-50ng/ml培養基，Noggin100-1000ng/ml培養基；濃度過小則作用不佳，濃度過大則成本太昂貴。更為優選的濃度是，bFGF10-40ng/ml培養基，Noggin250-500ng/ml培養基。所述普通hES細胞培養基是本領域技術人員常用的各種hES細胞培養基，比如，可用如實施例中的配方一的普通hES細胞培養基。實驗證明，在普通hES細胞培養基里同時加入bFGF(10-40ng/ml)和Noggin(250-500ng/ml)，hES細胞不僅能正常生長，還能多次傳代，并保持其未分化狀態及分化為內、中、外三個胚層細胞的潛能。在本專利技術上述提供的人胚干細胞培養基中，還可加入Bovine Fibronectin(一種纖連蛋白，簡稱Fibronectin)。實驗證明，可增加hES細胞的克隆率，并加快其生長速度。Fibronectin的用量可以是0.5-50μg/ml)，優選用量是0.5-5μg/ml。或者，在本專利技術上述加入bFGF和Noggin的人胚干細胞培養基中，加入肝素(Heparin)。實驗證明，可減少價格較貴的bFGF的用量，至少將bFGF用量減半。這樣可以降低成本。肝素的用量可以是5-50μg/ml)，優選用量是10-30μg/ml。也可以在本專利技術上述提供的人胚干細胞培養基中同時加入Fibronectin和Heparin。本專利技術以上所述的bFGF、Noggin、Fibronectin和Heparin四種物質，均可通過市售等方式購到。具體實施例方式本專利技術所用試劑與實驗材料如下所述1、細胞a)hES細胞(Hl)由美國威斯康星大學WiCell研究所提供；b)照射處理后的MEFs(鼠胚成纖維細胞)由北京大學實驗動物中心提供的ICR孕鼠體內的鼠胚制備而成；(方法參見Thomson JA，Itskovit(z-Eldor J，ShapiroSS，Waknitz MA，Swiergiel JJ，Marshall VS，Jones JM.Embryonic stem celllines derived from human blastocysts.Science. 1998 Nov6；282(5391)1145-7.)2、細胞培養基a)普通hES細胞基配方一D-MEM/F12 (Invitrogen，#11330-032)200mlKnockOutTM Serum Replacement (Invitrogen，#10828-028) 50ml NEAA(非必需氨基酸，Invitrogen，#11140-050) 2.5ml谷氨酰胺/巰基乙醇溶液(見配方三) 1.25mlbFGF溶液(見配方四) 0.5mlb)鼠胚成纖維細胞培本文檔來自技高網...

【技術保護點】
人胚干細胞培養基，特征是在普通ｈＥＳ細胞培養基中加入４－５０ｎｇ／ｍｌｂＦＧＦ和１００－１０００ｎｇ／ｍｌＮｏｇｇｉｎ。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：李東升，鄧宏魁，
申請(專利權)人：十堰市太和醫院，北京大學，
類型：發明
國別省市：42[中國|湖北]