在受損神經(jīng)系統(tǒng)中維持神經(jīng)細胞的營養(yǎng)培養(yǎng)基技術(shù)方案

提供了一種在腦或脊髓損傷或手術(shù)后提高人類腦或脊髓組織中神經(jīng)細胞生存力的方法。該方法包括對腦或脊髓組織施用含水的無菌液體培養(yǎng)基，其中所述含水的無菌液體培養(yǎng)基含有０－約３０００μＭ　　ＣａＣｌ↓［２］、約０．１－約１．２μＭ　　Ｆｅ（ＮＯ↓［３］）↓［３］、約２５００－約１００００μＭ　　ＫＣｌ、０－約４０００μＭ　　ＭｇＣｌ↓［２］、約３００００－約１５００００μＭ　　ＮａＣｌ、約１００－約３００００μＭ　　ＮａＨＣＯ↓［３］、約２５０－約４０００μＭ　　ＮａＨ↓［２］ＰＯ↓［４］、約０．０１－約０．４μＭ亞硒酸鈉、約０．２－約２μＭ　　ＺｎＳＯ↓［４］、約２５００－約５００００μＭ　　Ｄ－葡萄糖、約１－約５０μＭ　　Ｌ－肉堿、約３－約８０μＭ乙醇胺、約１５－約４００μＭ　　Ｄ（＋）－半乳糖、約４０－約８００μＭ腐胺、約２０－約５００μＭ丙酮酸鈉以及對神經(jīng)元生長有效的量的促進生長必需的脂肪酸、激素和抗氧化劑，且基本上不含硫酸亞鐵、谷氨酸鹽和天冬氨酸鹽。（*該技術(shù)在2022年保護過期，可自由使用*）

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種維持經(jīng)照射、受損或分離的神經(jīng)細胞生存力的經(jīng)過改進的含水培養(yǎng)基。本專利技術(shù)還涉及維持經(jīng)照射、受損或分離的神經(jīng)細胞生存力的改進方法。本專利技術(shù)還涉及將這種改進的培養(yǎng)基用于人類患者神經(jīng)外科的方法。
技術(shù)介紹
研究受損中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織的主要問題是維持細胞生存力。無法在各種環(huán)境條件下使維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織的生存力在培養(yǎng)物中維持較長時間，這曾經(jīng)阻止了治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的有效治療方案的發(fā)展。最近開發(fā)了一種在高二氧化碳氣氛(5％CO2)下維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織生存力的營養(yǎng)平衡鹽溶液(培養(yǎng)基)。NeurobasalTM(Gibco/Invitrogen股份有限公司，Rockville，MD)是能使胚胎大鼠海馬神經(jīng)元在pH 7.3、5％ CO2下生長最優(yōu)的碳酸氫鹽緩沖培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基是Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)的衍生物并可優(yōu)化胚胎大鼠海馬細胞的存活率。與DMEM相比，NeurobasalTM含較少NaCl和NaHCO3，這使其滲量降低并含有較少量的半胱氨酸和谷氨酰胺，從而導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)生長降低。此外，NeurobasalTM含有丙氨酸、天冬酰胺、脯氨酸和維生素B12，而這些DMEM都不含有。盡管神經(jīng)元可在5％CO2氣氛下保持在高碳酸氫鹽培養(yǎng)基中，當添加B27(一種獲自Invitrogen公司的激素和抗氧化劑添加物)時，當轉(zhuǎn)移到環(huán)境CO2條件(約0.2％)時神經(jīng)元迅速死亡。死亡與培養(yǎng)基pH迅速升高至約8.1有關(guān)。制造和研究神經(jīng)組織和細胞通常需要在培養(yǎng)箱外使用環(huán)境CO2水平。現(xiàn)有控制培養(yǎng)箱外細胞pH的方法包括使用弱緩沖液(如Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基或L 15培養(yǎng)基中使用的緩沖液)并用5-10％CO2連續(xù)吹氣以維持生理pH。然而，一個簡單的試驗顯示，環(huán)境CO2會使培養(yǎng)箱外DMEM的pH迅速升高至約8.1。通常用HEPES緩沖的做法會減慢，但不能阻止這種實質(zhì)性的堿化。對組織連續(xù)吹氣的做法可保持高CO2水平和生理pH，但設(shè)備笨重且成本昂貴。美國專利6,180,404(2001.1.30)，該專利屬于本申請相同受讓人并被并入以供參考，提供了在環(huán)境CO2條件下維持神經(jīng)細胞的培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基含有少于約2000μM碳酸氫鹽(pKa為約6.9-約7.7的緩沖液)、0-約3000μM CaCl2、約0.05-約0.8μM Fe(NO3)3、約2500-約10000μM KCl，0-約4000μM MgCl2、約74000-約103000μM NaCl、約400-約2000μM NaHCO3、約250-約4000μM NaH2PO4、約0.2-約2μM ZnSO4、約2500-約50000μM D-葡萄糖和約20-約500μM丙酮酸鈉，且其中所述培養(yǎng)基基本上不含硫酸亞鐵、谷氨酸鹽和天冬氨酸鹽。這種培養(yǎng)基的一種形式可以商品名HibernateTM購得。優(yōu)選地，這種培養(yǎng)基添加有B27(一種含有效量激素的促進生長的添加物)、必需脂肪酸和抗氧化劑以使神經(jīng)細胞生長。該領(lǐng)域還需要一種改進的培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基可維持生理pH，并可在受損的腦和脊髓組織中提供高神經(jīng)細胞生存力，在受損的腦和脊髓組織中，受到損傷的血液供應(yīng)會減少CO2和其它營養(yǎng)物、激素和/或促進再生和/或防止或顯著降低退化的生長因子。本專利技術(shù)提供了這種改進的培養(yǎng)基。腦腫瘤是15歲以下兒童和34歲以上青年中的第二大致死腫瘤。腦腫瘤是65歲以上成年中第二大發(fā)展最快的致死腫瘤。與許多其它腫瘤不同，行為改變似乎不會顯著降低諸如腦腫瘤的風(fēng)險。盡管約40％或50％的腦癌是良性的，但良性腦癌也會導(dǎo)致顯著損傷和死亡。美國每年約有100,000人被診斷患有原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腦腫瘤。只要腫瘤部位許可，通常可用外科手術(shù)技術(shù)來除去腦腫瘤。手術(shù)部位(即蛛網(wǎng)膜下隙、腦薄壁組織和切除腔)通常用生理鹽水沖洗，有時還要用浸在生理鹽水中的物質(zhì)包扎。因此，就需要有可用于神經(jīng)外科以提高神經(jīng)細胞生存力和/或促進神經(jīng)細胞再生和/或促進神經(jīng)細胞分化的改進培養(yǎng)基和方法。這種改進的培養(yǎng)基和方法可用來沖洗或浸泡手術(shù)位置和/或用來浸漬或浸透填料(例如，明膠-泡沫海綿)，所述填料在除去腫瘤或其它神經(jīng)組織后仍留在腔內(nèi)。本專利技術(shù)提供了這種改進的培養(yǎng)基和方法。專利技術(shù)概述一方面，本專利技術(shù)提供了一種在腦或脊髓損傷或手術(shù)后提高人類腦或脊髓組織中神經(jīng)細胞生存力的方法，所述方法包括對腦或脊髓組織施用無菌含水液體培養(yǎng)基，其中所述含水的無菌液體培養(yǎng)基含有0-約3000μM CaCl2、約0.1-約1.2μMFe(NO3)3、約2500-約10000μM KCl、0-約4000μM MgCl2、約30000-約150000μMNaCl、約100-約30000μM NaHCO3、約250-約4000μM NaH2PO4、約0.01-約0.4μM亞硒酸鈉、約0.2-約2μM ZnSO4、約2500-約50000μM D-葡萄糖、約1-約50μM L-肉堿、約3-約80μM乙醇胺、約15-約400μM D(+)-半乳糖、約40-約800μM腐胺、約20-約500μM丙酮酸鈉以及神經(jīng)元生長有效量的促進生長必需的脂肪酸、激素和抗氧化劑，且基本上不含硫酸亞鐵、谷氨酸鹽和天冬氨酸鹽。所述無菌液體培養(yǎng)基還可含有有效量的脫氫表雄酮-4-硫酸鹽(DHEAS)以維持激素水平；通常，有效量的DHEAS是約2-約200μM，更優(yōu)選約5-約100μM。所述無菌液體培養(yǎng)基還可含有有效量的堿性成纖維細胞生長因子(堿性FGF或FGF2)以協(xié)助支持神經(jīng)元的存活和再生；通常有效量的FGF2是約1-約50ng/ml，更優(yōu)選約2-約20ng/ml。特別優(yōu)選用于本專利技術(shù)的FGF2是獲自Invitrogen有限公司(Rockville，MD)的堿性人重組成纖維細胞生長因子。更優(yōu)選地，所述無菌液體培養(yǎng)基含有有效量的DHEAS和FGF2。這種優(yōu)選的組合物通常含有約5-約50μM DHEAS和約1-約50ng/ml FGF2，更優(yōu)選約10-約30μM DHEAS和約2-約20ng/ml FGF2。另一方面，本專利技術(shù)提供了一種將生存力增強的干細胞或神經(jīng)系統(tǒng)細胞或組織輸遞入人的腦、脊髓或神經(jīng)系統(tǒng)的方法，所述方法包括(1)在將干細胞或神經(jīng)系統(tǒng)細胞或組織輸遞入人的腦、脊髓或神經(jīng)系統(tǒng)之前或之時用含水的無菌液體培養(yǎng)基處理所述干細胞或神經(jīng)系統(tǒng)細胞或組織，和(2)輸遞經(jīng)處理的干細胞或神經(jīng)系統(tǒng)細胞或組織至人的腦、脊髓或神經(jīng)系統(tǒng)，其中所述含水的無菌液體培養(yǎng)基含有0-約3000μM CaCl2、約0.01-約1.2μM Fe(NO3)3、約2500-約10000μM KCl、0-約4000μMMgCl2、約30000-約150000μM NaCl、約100-約30000μM NaHCO3、約250-約4000μM NaH2PO4、約0.01-約0.4μM 亞硒酸鈉、約0.2-約2μM ZnSO4、約2500-約50000μM D-葡萄糖、約1-約50μM L-肉堿、約3-約80μM 乙醇胺、約15-約400μM D(+)-半乳糖、約40-約800μM 腐胺、約20-約500μM 丙酮酸鈉，和對神經(jīng)元生長有效的量的促進生長必需的脂肪酸、激素和抗氧化劑，其中所述無菌液體培養(yǎng)基的滲量為約200-約270mOs本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種在腦或脊髓損傷或手術(shù)后提高人類腦或脊髓組織中神經(jīng)細胞生存力的方法，其特征在于，所述方法包括對腦或脊髓組織施用含水的無菌液體培養(yǎng)基，所述含水的無菌液體培養(yǎng)基含有０－約３０００μＭＣａＣｌ↓［２］、約０．１－約１．２μＭＦｅ（ＮＯ↓ ［３］）↓［３］、約２５００－約１００００μＭＫＣｌ、０－約４０００μＭＭｇＣｌ↓［２］、約３００００－約１５００００μＭＮａＣｌ、約１００－約３００００μＭＮａＨＣＯ↓［３］、約２５０－約４０００μＭＮａＨ↓［２］ＰＯ ↓［４］、約０．０１－約０．４μＭ亞硒酸鈉、約０．２－約２μＭＺｎＳＯ↓［４］、約２５００－約５００００μＭＤ－葡萄糖、約１－約５０μＭＬ－肉堿、約３－約８０μＭ乙醇胺、約１５－約４００μＭＤ（＋）－半乳糖、約４０－約８００ μＭ腐胺、約２０－約５００μＭ丙酮酸鈉以及對神經(jīng)元生長有效的量的促進生長必需的脂肪酸、激素和抗氧化劑，所述無菌液體培養(yǎng)基的滲量為約２００－約２７０ｍＯｓｍ，含有約５０００－約２５０００μＭ氫離子緩沖液，緩沖液的ｐＫａ為約６．９－約７．７，且基本上不含硫酸亞鐵、谷氨酸鹽和天冬氨酸鹽。...

【技術(shù)特征摘要】
...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：GJ布魯爾，
申請(專利權(quán))人：南伊利諾斯州立大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：US[美國]