一種獲得活化的半相合ＨＬＡ異基因混合性造血干細胞的方法，該方法包括采集癌癥患者及其家屬的外周血，對于血型相同的患者及家屬，采集外周血干細胞前對患者及其家屬進行ＨＬＡ合血，將采集到的外周血干細胞在特定的培養基中培養；如果患者與其家屬血型不合，先將采集到的外周血分別分離成單個核細胞，然后再用與上述相同的培養基共同培養。（*該技術在2023年保護過期，可自由使用*）
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及到一種干細胞及其制備方法，具體來說，本專利技術提供了一種活化的HLA半相合異基因混合性造血干細胞及其制備方法，該干細胞得自母體，與其后代中的干細胞微嵌合，具有抗腫瘤作用。將該細胞回輸到體內后，能提高免疫力，從而殺死腫瘤和抗擊目前正流行的SARS病毒。
技術介紹
研究成果表明，可以利用各種來源的干細胞，來治療衰老、外傷、遺傳性及代謝性疾病，具有良好的臨床應用前景。干細胞通過體外克隆培養和定向誘導，可以成為1)合適的細胞移植材料，用于修復受損傷器官；2)干細胞作為轉基因載體，用于轉基因治療；3)利用干細胞移植治療人類頑癥如骨髓干細胞或臍帶血干細胞移植治療白血病等。干細胞系的建立必需滿足兩個條件在細胞周期內復制可得到大量子代細胞，即具有永生化特性；細胞系必需保持原始細胞的世系遺傳顯型特征。目前研究首先要解決的問題是如何獲得可用于臨床應用的干細胞系，并能夠在體外擴增。國外已有多種技術路線建立干細胞系1)來自神經管和神經嵴派生的祖先細胞建立細胞系。2)從自然發生腫瘤細胞中分離細胞系，如由Augusti-Tocco和Sato，Schubert等(1969)建立的小鼠神經母細胞瘤(mouse neuroblastomaC1300)，人類大腦皮質瘤也建立了具有神經元特性的細胞系(Ronnett等，1990)。3)利用X-rays或化學誘導劑誘導腫瘤細胞，建立分離神經細胞系，如被廣泛應用的PC12細胞系是由X-rays誘導建立(Greene和Tischler，1976)。4)用逆轉病毒載體或腺病毒載體攜帶原癌基因特異轉染神經前體細胞(neuralprecusor)建立細胞克隆。5)建立攜帶含神經腫瘤細胞系雜交，建立永生化神經細胞系(Greene等，1975；Choi等，1991)。7)采用原代中樞神經無血清培養，表皮生長因子(EGF)刺激，獲得永生化細胞克隆(Reynolds和Weiss，1992；Ray等，1993)。8)利用胚胎干細胞定向誘導建立神經干細胞系，如Gottlieb(華盛頓大學)用Retinoic酸誘導神經元樣細胞。9)目前最新研究動態關注，與調控細胞壽命有關的染色體目短DNA重復序列，即端粒。少數細胞每一次分裂增殖后，由端粒酶重建端粒，保持細胞永生化。上述技術盡管可獲得干細胞，但有些技術涉及胚胎干細胞的有關倫理問題，有些細胞系與癌變細胞不易區分，利用病毒載體轉染目的基因獲得的干細胞有臨床使用安全性問題等，人們期望一項技術可獲得臨床能應用的干細胞系。在國內，干細胞領域的研究逐漸受到多個學科的重視。國內研究已涉及皮膚、軟骨及神經系統損傷的人體組織工程的研究。造血干細胞的移植已經拯救許多患白血病患者的生命。目前國內研究的狀況為以上海市轉基因研究所和上海市第二醫科大學的成國祥博士、盛惠珍教授和曹誼林教授為代表的利用人胚胎干細胞的技術路線，分化人類特定的組織器官，如皮膚、軟骨心臟、肝臟等，但該方法存在倫理問題。北京中科院系統以陳大元教授為代表的克隆國寶大熊貓為國家重大課題。昆明中科院系統以靈長類克隆為主要特色。西北農業科技大學農業部開放實驗室以畜牧業為主要研究方向。目前全國許多有實力的或地方特色的實驗室，都在積極開展該項研究。已經證明，微移植的干細胞進行可以殺死白血病細胞(參見Champlin.R等，Reinventing bone marrow transplantationreducing toxicity usingnonmyeloablative，preparative regimens and induction of graft-versus-malignancy，Curr Opin Oncol，1999，1187-91)。Artlertt.CM等已經報道，在懷孕多年后母體與其后代的細胞仍是嵌合的(參見Artlertt.CM等，Identification of fetalDNA and cells in skin lesions from women with systemic sclerosis，N Engl JMed，1998，3381186-91)，因此，母體可能可以耐受其后代的細胞并允許注入的細胞存在而產生一種具有抗腫瘤效果的移植。
技術實現思路
于是，本專利技術的目的就在于提供一種活化的HLA半相合異基因混合性造血干細胞，該干細胞得自供體，與其受體中的淋巴細胞微嵌合，具有抗腫瘤作用。其中的受體可以是女兒、兒子，供體是父親、母親或者供體是女兒、兒子，受體是父親、母親。本專利技術的另一個目的是提供一種獲得上述干細胞的方法，該方法包括采集癌癥患者及其家屬的外周血，對于血型相同的患者及家屬，采集外周血干細胞前對患者及其家屬進行合血，將采集到的外周血干細胞倒入特定的培養基中培養；如果患者與其家屬血型不合，先將采集到的外周血分別分離成單個核細胞，然后再用與上述相同的培養基共同培養。其中的家屬包括兒子和女兒。將培養的外周血干細胞收集，洗滌，回輸給患者，回輸后發現病人食欲增加，睡眠改善，體力狀況指標提高，個別病理有水腫，進一步治療后明顯好轉。這表明將該細胞回輸到體內后，能提高免疫力，從而殺死腫瘤，因此，可以預見該干細胞對于抗擊目前正流行的SARS(severe acute respiratory syndrome，急性呼吸窘迫綜合癥)病毒也具有一定的作用。上述培養方法中所用的培養基命名為X-VIV020(CAMBREX)，含有Iscove改良的Dulbecco基本培養基(IMDM)、100-5000U/ml的IL-2、0.1-10ug/ml的脂肪酸、1.5ug/ml的膽固醇、5-20ug/ml的甘油酯、100-5000U/ml的γ-干擾素、300ug/ml的轉鐵蛋白。緩沖溶液是碳酸氫納或HEPES，培養基的pH值為7.0。附圖說明圖1HLA分型PCR電泳圖，陽性產物大小約為500bp。圖2用X-VIV020培養基培養得到的細胞集落。具體實施例方式本專利技術用下面的實施例作進一步的說明，但對本專利技術的范圍不起限制作用。實施例1培養干細胞的培養基X-VIV020(CAMBREX)在IMDM中加入亞油酸8ug/ml、膽固醇1.5ug/ml、甘油二酯15ug/ml、Tween80 5ug/ml、γ-干擾素1000U/ml、轉鐵蛋白300ug/ml，2600ug/mlHEPES緩沖液(pH 7.0)、2500ug/ml碳酸氫鈉。在使用培養基之前，向培養基中加入1000U/ml的IL-2。實施例2干細胞的來源干細胞來源于一名癌癥患者的外周血，該患者是一名52歲的亞洲婦女，患有嚴重分化性上皮胸腺癌。她嚴重地呼吸短促并具有晚期的靜脈腔綜合癥，在計算機上進行CT掃描發現一個大地縱隔腫瘤、一個包心塊、越來越多的左上和右中腦腦節腫瘤塊、右肝塊。她的總Karnofsky得分是30-40，Ca19-9是70U/ml(正常是35)。她的體重下降了60Kg，預期的生命非常短。其女兒正常。實施例3干細胞的分離與培養用粒性白細胞巨噬細胞克隆刺激因子(GM-CSF)處理女兒5天后從患者女兒的外周血中取出血樣，如果該患者與其女兒的血型相合，則進行合血，用美國Baxter公司CS-3000plus血細胞分離機分離合血后的外周血樣中的單個本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：任秀寶，
申請(專利權)人：任秀寶，
類型：發明
國別省市：
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