用改變程序的供體染色質或供體細胞克隆哺乳動物的方法技術

本發明專利技術提供克隆哺乳動物的方法，在這些方法中，使供體染色體或供體細胞在插入去核的卵母細胞之前，先進行改變程序。本發明專利技術還描述了將染色體或細胞核插入受體細胞的方法的特征。（*該技術在2021年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

技術介紹
概括地說，本專利技術描述了改進的克隆哺乳動物的方法、以及將染色體、細胞核或染色質團插入受體細胞的方法。哺乳動物的克隆能夠產生多個DNA內容等同的哺乳動物。用于產生這些哺乳動物的供體遺傳物質可以通過選擇或基因工程方法獲得，從而使克隆的哺乳動物具有所要求的性質，例如對疾病抗性的增強。但遺憾的是，用供體的體細胞克隆哺乳動物的有效率一般是很低的，只能導致約1-2％的核移植胚胎發育至足月(Polejaeva等，Nature40786-90，2000)。克隆的一個嚴重問題是后代在妊娠中晚期的丟失或存活率低。因此，需要有更有效的方法來克隆哺乳動物。這些改進的方法有可能減少產生多個存活后代所需要的成本和時間。專利技術概述本專利技術的目的是提供改進的克隆哺乳動物的方法。尤其是，這些方法包括將供體細胞核凝聚成染色質團，使細胞核的成分，例如轉錄因子，可以釋放出來，該轉錄因子可促進某些基因的轉錄，而這些轉錄對核移植的胚胎發育成存活的后代來說是不希望有的。在有關的方法中，透化細胞與改變程序(reprogramming)的培養基(如細胞提取物)一起溫育，使某些因子進入細胞，或從細胞去除，然后使該透化細胞的原生質膜重新封閉而將所需要的因子包入，并恢復該細胞膜的完整性。必要時，可重復這些方法中的任何步驟1次或多次，或可連續進行不同的改變程序的方法，以增加改變程序的程度，導致克隆的胎兒具有更大的存活能力。本專利技術還提供產生嵌合胚胎的方法，該嵌合胚胎中，一些或全部的胎盤組織來自于一種遺傳源，而大部分胎兒組織來自另一種遺傳源。這些嵌合胚胎的胎盤異常性較少，從而使其存活率增加。此外，還建立了一種新的將染色質團或細胞核插入受體卵母細胞中的方法，該方法包括致融合(fusigenic)化合物的使用。因此，第一方面，本專利技術提供一種克隆哺乳動物的方法。該方法包括(a)將包含少于4套同源染色體(即含有少于2對完全染色單體)的供體細胞核在使染色質團形成而不引起DNA復制的條件下進行溫育，(b)將染色質團插入去核的卵母細胞，從而形成核轉移卵母細胞，以及(c)在使核轉移卵母細胞或胚胎發育為胎兒的條件下，將該核轉移卵母細胞或由該核轉移卵母細胞形成的胚胎轉移至宿主哺乳動物的子宮。在優選的實施方案中，在使細胞核或細胞質的成分，例如轉錄因子、阻遏蛋白或染色質重塑蛋白能加入細胞核或所產生的染色質團中，或從其中除去的條件下，將供體細胞核與改變程序的培養基(如細胞提取物)一起溫育。優選供體細胞核在使染色質團形成的條件下與一種或多種下述的物質接觸在抗NuMA抗體存在或不存在下的有絲分裂提取物、去污劑和/或鹽的溶液、或蛋白激酶溶液。在其他優選的實施方案中，重建的卵母細胞或所產生的胚胎的核纖維蛋白A，核纖維蛋白C，或NuMA蛋白的表達水平比細胞數相同并來源同一物種的對照卵母細胞或對照胚胎的相應表達水平高不到5倍。在相關的方面，本專利技術提供另一種克隆哺乳動物的方法。該方法包括使透化細胞與改變程序的培養基(例如細胞提取物)在使某種因子(例如，細胞核或細胞質的成分，如轉錄因子)能從透化細胞的細胞核、染色質團、或染色體中除去、或將某種因子加入該細胞核、細胞質團、或染色體中的條件下溫育，從而形成改變程序的細胞。將該改變程序的細胞插入去核的卵母細胞，然后將所產生的卵母細胞或由此卵母細胞形成的胚胎，在使卵母細胞或胚胎能發育成胎兒的條件下，轉移至宿主哺乳動物的子宮中。在優選的實施方案中，該透化細胞在使染色質團形成的條件下與一種或多種下述物質接觸在抗NuMA抗體存在或不存在下的有絲分裂提取物、去污劑和/或鹽的溶液、或蛋白激酶溶液。還有一個實施方案中，透化細胞與分裂間期的改變程序培養基(例如分裂間期的細胞提取物)一起溫育。在另外還有一個優選的實施方案中，透化細胞中的細胞核仍保持膜包圍的狀態，而且核中的染色體在與該分裂間期的改變程序培養基溫育期間不凝聚。在某些實施方案中，透化細胞在改變程序培養基中溫育不會引起該細胞的DNA的復制，或者僅引起少于50、40、30、20、10或5％的細胞的DNA復制。在其他實施方案中，透化細胞在改變程序培養基中的溫育至少引起60、70、80、90、95、或100％的細胞的DNA復制。在各種實施方案中，通過使完整細胞與去污劑，如毛地黃皂苷、或細菌毒素，如鏈球菌溶血素O，一起溫育而形成透化細胞。還有另一個優選的實施方案中，改變程序的細胞在使該細胞的膜重新封閉的條件下進行溫育，然后將其插入卵母細胞。在其他優選的實施方案中，重建的卵母細胞或所產生的胚胎的核纖維蛋白A、核纖維蛋白B、或NuMA蛋白的表達水平比細胞數相同并來源同一物種的對照卵母細胞或對照胚胎的相應表達水平高不到5倍。本專利技術還提供包括使用來自兩種不同胚胎的細胞克隆哺乳動物的方法。例如，來源于核轉移胚胎(例如，通過將細胞、細胞核、或染色質團插入去核卵母細胞而形成的胚胎)的細胞可以與來源于體外受精的、自然產生的、或單性激活的胚胎的細胞結合。優選來源于核轉移胚胎的大部分細胞及其后代摻入所產生的嵌合胚胎的胎兒組織中。優選至少來源于第二胚胎的一些細胞及其后代進入胎盤組織中，并提高所產生的嵌合胚胎的存活力。因此，在一個方面，本專利技術描述了一種克隆哺乳動物的方法的特征，該方法包括將細胞、細胞核，或染色質團插入去核的卵母細胞中，以而形成第一胚胎。一個或多個來源于第一胚胎的細胞與一個或多個來源于體外受精的、自然產生的，或單性激活的第二胚胎的細胞接觸，形成第三胚胎。將此第三胚胎在使第三胚胎能發育成為胎兒的條件下轉移至宿主哺乳動物的子宮中。在一個實施方案中，至少第一胚胎和第二胚胎之一是致密(compaction)的胚胎。在另一個實施方案中，第一胚胎和第二胚胎處于不同細胞時期。第一胚胎和用來產生第二胚胎的供體細胞可以來自同一個種，或來自不同的屬或種。優選胎兒的滋養外胚層或胎盤組織中，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、95或100％的細胞來自第二胚胎，或者在胎兒的內層細胞團或胎組織中，至少30、40、50、60、70、80、90、95或100％的細胞來自第一胚胎。在另一個優選的實施方案中，第一胚胎或第三胚胎的核纖維蛋白A、核纖維蛋白C、或NuMA蛋白的表達水平比細胞數相同并來源于同一個物種的對照卵母細胞或對照胚胎的相應表達水平高不到5倍。在相關的方面，本專利技術描述了另一種克隆哺乳動物的方法的特征。該方法包括在使染色質團形成的條件下，使供體細胞核與改變程序的培養基(例如細胞提取物)接觸；并將此染色質團插入去核的卵母細胞，以而形成第一胚胎。一個或多個來源于第一胚胎的細胞與一個或多個來源于體外受精的、自然產生的，或單性激活的第二胚胎的細胞接觸，形成第三胚胎。將此第三胚胎在使第三胚胎能發育成為胎兒的條件下，轉移至宿主哺乳動物的子宮中。在優選的實施方案中，染色質團形成的方法是，使含有少于4套同源染色體的供體細胞核在使染色質團形成、而又不引起DNA復制的條件下，與改變程序培養基接觸。優選細胞核在使染色質團形成的條件下，與一種或多種下述物質接觸在抗NuMA抗體存在或不存在下的有絲分裂提取物、去污劑和/或鹽的溶液、或蛋白激酶溶液。在各種實施方案中，第一胚胎和第二胚胎都是致密的胚胎； 第一胚胎和第二胚胎都是前致密(precompa本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種克隆非人哺乳動物的方法，該方法包括以下步驟：（ａ）使透化細胞在改變程序的培養基中溫育，從而形成改變程序的細胞，溫育的條件是：使一種因子從所說的透化細胞的細胞核、染色質團、或染色體中除去，或從改變程序的培養基中將一種因子加入所說的 細胞核、染色質團、或染色體中；（ｂ）將所說的改變程序的細胞插入有核的或去核的卵母細胞中，以而形成核轉移卵母細胞；以及（ｃ）將所說的核轉移卵母細胞或由該核轉移卵母細胞形成的胚胎，在使該核轉移卵母細胞能發育成胎兒的條件下，轉移入 宿主哺乳動物的子宮中。

【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：P科拉斯，JM羅布爾，E沙利文，P卡西納坦，
申請(專利權)人：麒麟醫藥株式會社，
類型：發明
國別省市：JP[日本]