一種針對(duì)胰腺癌的Car?T細(xì)胞制備方法技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)了一種針對(duì)胰腺癌的Car?T細(xì)胞制備方法，該方法包括如下步驟：采集患者外周血，提取外周血單個(gè)核細(xì)胞；將核細(xì)胞用PBS洗滌，棄去上清液，取細(xì)胞沉淀中加入GT551重懸；將核細(xì)胞以1x10

\u4e00\u79cd\u9488\u5bf9\u80f0\u817a\u764c\u7684Car\u2011T\u7ec6\u80de\u5236\u5907\u65b9\u6cd5

The invention discloses a method for pancreatic cancer cell T Car preparation method, the method comprises the following steps: collecting the peripheral blood of patients with extraction of peripheral blood mononuclear cells; nuclear cells were washed with PBS, discard supernatant, GT551 cells were added precipitate resuspended; nuclear cells by 1x10

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種針對(duì)胰腺癌的Car-T細(xì)胞制備方法
本專(zhuān)利技術(shù)屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種針對(duì)胰腺癌的Car-T細(xì)胞制備方法。
技術(shù)介紹
胰腺癌是一種惡性程度很高，診斷和治療都很困難的消化道惡性腫瘤，約90％為起源于腺管上皮的導(dǎo)管腺癌。其發(fā)病率和死亡率近年來(lái)明顯上升。5年生存率<1％，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。胰腺癌早期的確診率不高，手術(shù)死亡率較高，而治愈率很低。本病發(fā)病率男性高于女性，男女之比為1.5～2:1，男性患者遠(yuǎn)較絕經(jīng)前的婦女多見(jiàn)，絕經(jīng)后婦女的發(fā)病率與男性相仿。胰腺癌的病因尚不十分清楚。其發(fā)生與吸煙、飲酒、高脂肪和高蛋白飲食、過(guò)量飲用咖啡、環(huán)境污染及遺傳因素有關(guān)；近年來(lái)的調(diào)查報(bào)告發(fā)現(xiàn)糖尿病人群中胰腺癌的發(fā)病率明顯高于普通人群；也有人注意到慢性胰腺炎病人與胰腺癌的發(fā)病存在一定關(guān)系，發(fā)現(xiàn)慢性胰腺炎病人發(fā)生胰腺癌的比例明顯增高；另外還有許多因素與此病的發(fā)生有一定關(guān)系，如職業(yè)、環(huán)境、地理等。胰腺癌臨床表現(xiàn)取決于癌的部位、病程早晚、有無(wú)轉(zhuǎn)移以及鄰近器官累及的情況。其臨床特點(diǎn)是整個(gè)病程短、病情發(fā)展快和迅速惡化。最多見(jiàn)的是上腹部飽脹不適、疼痛。雖然有自覺(jué)痛，但并不是所有病人都有壓痛，如果有壓痛則和自覺(jué)痛的部位是一致的。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)的目的在于提供一種針對(duì)胰腺癌的Car-T細(xì)胞制備方法，該方法提供了一種行之有效的胰腺癌治療方法，并且有效降低患病復(fù)發(fā)幾率。本專(zhuān)利技術(shù)是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種針對(duì)胰腺癌的Car-T細(xì)胞制備方法，該方法包括如下步驟：S1、采集患者外周血，提取外周血單個(gè)核細(xì)胞；S2、將S1中得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞用PBS洗滌，棄去上清液，取細(xì)胞沉淀中加入GT551重懸；S3、將S2中得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞以1x106個(gè)/孔接種于24孔板中，于每孔中加入培養(yǎng)液和60IU/mLIL-2，培養(yǎng)24-36h，之后每孔板中加入20-40μLPersonGenTM生物膜；S4、每隔16-18h將S3中培養(yǎng)的細(xì)胞分孔一次，每孔補(bǔ)充培養(yǎng)液1-2mL，每隔36-48h補(bǔ)充PersonGenTM生物膜10-15μL，持續(xù)培養(yǎng)16-18d；S5、將慢病毒對(duì)S4中的T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染并擴(kuò)增培養(yǎng)，獲得CAR-T細(xì)胞。進(jìn)一步地，所述S1中的具體步驟為，采集患者外周富集血，濾除白細(xì)胞后緩慢移入裝有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，用密度梯度離心法離心，吸取白膜層，得到外周血單個(gè)核細(xì)胞。進(jìn)一步地，S2中所述培養(yǎng)液成分為RPMI1640中加入10％FBS。進(jìn)一步地，S2中重懸后調(diào)整細(xì)胞濃度為2-2.5x106。本專(zhuān)利技術(shù)具有以下有益效果：本專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)了一種針對(duì)胰腺癌的Car-T細(xì)胞的制備方法，該方法通過(guò)采集胰腺癌患者外周血得到單個(gè)核細(xì)胞，并將核細(xì)胞接種于加入有PersonGenTM生物膜的24孔板中，通過(guò)體外培養(yǎng)得到T細(xì)胞，并用病毒感染的方法得到CAR-T細(xì)胞，得到的Car-T細(xì)胞可以通過(guò)細(xì)胞制劑注射進(jìn)入胰腺癌患者體內(nèi)，該方法提供了一種行之有效的胰腺癌治療方法，并且有效降低患病復(fù)發(fā)幾率。當(dāng)然，實(shí)施本專(zhuān)利技術(shù)的任一產(chǎn)品并不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有優(yōu)點(diǎn)。具體實(shí)施方式本專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本專(zhuān)利技術(shù)一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本專(zhuān)利技術(shù)中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本專(zhuān)利技術(shù)保護(hù)的范圍。本專(zhuān)利技術(shù)為一種針對(duì)胰腺癌的Car-T細(xì)胞制備方法，該方法具體步驟如下：實(shí)施例1S1、采集患者外周富集血，濾除白細(xì)胞后緩慢移入裝有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，用密度梯度離心法離心，其中離心參數(shù)為2000r/min，20℃，15min，吸取白膜層，得到外周血單個(gè)核細(xì)胞；S2、將S1中得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞用PBS洗滌，棄去上清液，取細(xì)胞沉淀中加入GT551重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為2x106；S3、將S2中得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞以1x106個(gè)/孔接種于24孔板中，于每孔中加入培養(yǎng)液和60IU/mLIL-2，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)中培養(yǎng)24h，之后每孔板中加入20μLPersonGenTM生物膜；其中，所述培養(yǎng)液成分為RPMI1640中加入10％FBS；S4、每隔16h將S3中培養(yǎng)的細(xì)胞分孔一次，每孔補(bǔ)充培養(yǎng)液1-2mL，每隔36h補(bǔ)充PersonGenTM生物膜10μL，持續(xù)培養(yǎng)16d；S5、將慢病毒對(duì)S4中的T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染并擴(kuò)增培養(yǎng)，獲得CAR-T細(xì)胞。實(shí)施例2S1、采集患者外周富集血，濾除白細(xì)胞后緩慢移入裝有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，用密度梯度離心法離心，其中離心參數(shù)為2200r/min，25℃，20min，吸取白膜層，得到外周血單個(gè)核細(xì)胞；S2、將S1中得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞用PBS洗滌，棄去上清液，取細(xì)胞沉淀中加入GT551重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5x106；S3、將S2中得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞以1x106個(gè)/孔接種于24孔板中，于每孔中加入培養(yǎng)液和60IU/mLIL-2，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)中培養(yǎng)36h，之后每孔板中加入40μLPersonGenTM生物膜；其中，所述培養(yǎng)液成分為RPMI1640中加入10％FBS；S4、每隔18h將S3中培養(yǎng)的細(xì)胞分孔一次，每孔補(bǔ)充培養(yǎng)液2mL，每隔48h補(bǔ)充PersonGenTM生物膜15μL，持續(xù)培養(yǎng)16-18d；S5、將慢病毒對(duì)S4中的T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染并擴(kuò)增培養(yǎng)，獲得CAR-T細(xì)胞。實(shí)施例3S1、采集患者外周富集血，濾除白細(xì)胞后緩慢移入裝有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，用密度梯度離心法離心，其中離心參數(shù)為2100r/min，22℃，18min，吸取白膜層，得到外周血單個(gè)核細(xì)胞；S2、將S1中得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞用PBS洗滌，棄去上清液，取細(xì)胞沉淀中加入GT551重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.3x106；S3、將S2中得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞以1x106個(gè)/孔接種于24孔板中，于每孔中加入培養(yǎng)液和60IU/mLIL-2，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)中培養(yǎng)30h，之后每孔板中加入30μLPersonGenTM生物膜；其中，所述培養(yǎng)液成分為RPMI1640中加入10％FBS；S4、每隔17h將S3中培養(yǎng)的細(xì)胞分孔一次，每孔補(bǔ)充培養(yǎng)液1.5mL，每隔40h補(bǔ)充PersonGenTM生物膜12μL，持續(xù)培養(yǎng)16-18d；S5、將慢病毒對(duì)S4中的T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染并擴(kuò)增培養(yǎng)，獲得CAR-T細(xì)胞。以上內(nèi)容僅僅是對(duì)本專(zhuān)利技術(shù)所作的舉例和說(shuō)明，所屬本
的技術(shù)人員對(duì)所描述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類(lèi)似的方式替代，只要不偏離專(zhuān)利技術(shù)或者超越本權(quán)利要求書(shū)所定義的范圍，均應(yīng)屬于本專(zhuān)利技術(shù)的保護(hù)范圍。本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種針對(duì)胰腺癌的Car?T細(xì)胞制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：S1、采集患者外周血，提取外周血單個(gè)核細(xì)胞；S2、將S1中得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞用PBS洗滌，棄去上清液，取細(xì)胞沉淀中加入GT551重懸；S3、將S2中得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞以1x10

【技術(shù)特征摘要】
1.一種針對(duì)胰腺癌的Car-T細(xì)胞制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：S1、采集患者外周血，提取外周血單個(gè)核細(xì)胞；S2、將S1中得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞用PBS洗滌，棄去上清液，取細(xì)胞沉淀中加入GT551重懸；S3、將S2中得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞以1x106個(gè)/孔接種于24孔板中，于每孔中加入培養(yǎng)液和60IU/mLIL-2，培養(yǎng)24-36h，之后每孔板中加入20-40μLPersonGenTM生物膜；S4、每隔16-18h將S3中培養(yǎng)的細(xì)胞分孔一次，每孔補(bǔ)充培養(yǎng)液1-2mL，每隔36-48h補(bǔ)充PersonGenTM生物膜10-15μL，持續(xù)培養(yǎng)16...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張正亮，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：安徽惠恩生物科技股份有限公司，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：安徽,34