荷花體細胞胚胎發生途徑的再生用培養基及其應用制造技術

本發明專利技術提供了一種荷花體細胞胚胎發生途徑的再生用培養基及其應用。該培養基包括胚性愈傷誘導與增殖培養基和胚狀體發生培養基，培養方法是將外植體放入胚性愈傷誘導與增殖培養基中培養，誘導出愈傷組織并進行增殖培養；將愈傷組織塊轉移到胚狀體發生培養基中，發育形成胚狀體；將產生的胚狀體移入胚萌發培養基中進行萌發，發育形成子葉形胚；將萌發的子葉形胚移至含荷花成苗培養基中成苗培養，然后移栽至自然環境中。通過本發明專利技術的培養基培養，一個外植體能分化出一塊胚性愈傷團，從中能高效分化1000個以上的體細胞胚并最終萌發，既能促進荷花的轉基因發展，又可以為荷花的栽培應用提供大量的種苗。

The regeneration medium and its application of the pathway of the somatic embryogenesis of lotus

The present invention provides a medium for regeneration of the pathway of the lotus somatic embryogenesis and its application. The culture medium including induction and proliferation culture medium and embryogenesis medium of embryogenic callus, the explant culture method is in embryonic callus induction and proliferation culture medium, callus proliferation and culture; callus block transfer to embryogenesis medium, the formation of embryo; somatic embryo will produce in germination medium for germination, formation of cotyledon embryo; the cotyledon embryo to the germination of lotus seedlings containing culture medium in vitro, and then transplanted to the natural environment. Through the medium of the invention of the culture, a culture of a physical differentiation of embryogenic callus, from which efficient differentiation of somatic embryos of more than 1000 and final germination, which can promote the development of transgenic lotus, and can provide a large number of seedlings for the cultivation and application of lotus.

【技術實現步驟摘要】
荷花體細胞胚胎發生途徑的再生用培養基及其應用
本專利技術屬于組織培養
，具體而言，涉及植物的組織培養體系，尤其涉及一種荷花體細胞胚胎發生途徑的再生用培養基及其應用。
技術介紹
荷花(NelumbonuciferaGaertn.)為蓮科蓮屬多年生水生花卉，是中國十大傳統名花之一，具有很高的觀賞價值、經濟價值和獨特的文化內涵，深受人們喜愛。根據其用途，可分為藕蓮、籽蓮與花蓮。2013年，荷花品種--中國古代蓮的全基因組測序完成，為荷花的基因功能研究奠定了良好的基礎。然而，作為轉基因重要技術基礎的荷花遺傳轉化再生體系尚不成熟，嚴重制約了荷花轉基因工作的開展。盡管以荷花為研究對象的組織培養技術有研究并成功獲得植株再生的報道，但它的的組織培養不能象其它作物容易誘導再生(如小麥、水稻、玉米等形成胚性愈傷后多次繼代增殖與保存，并誘導高效分化和再生植株)，因此一直被認為是難以進行培養的園藝作物，限制了荷花組織培養及轉基因技術在育種領域的應用。一般來說，植株再生的途徑可分為兩種，一種途徑是由莖尖直接分化形成叢生苗，然后進行增殖，最后誘導生根獲得完整植株，即器官發生途徑。器官發生途徑的優點在于誘導過程相對簡單，但它的缺點在于增殖系數低，同時，此種再生途徑被認為是多細胞起源，易形成嵌合體，導致假陽性轉化植株的出現，因此在轉基因的應用上受很大的限制。對荷花來說，目前此途徑主要依靠荷花成熟胚在試管中離體培養出無菌苗，再用無菌苗的莖尖作為外植體誘導出愈傷，然后對愈傷組織誘導不定芽分化，最后生根成苗。關于用荷花成熟胚進行無菌苗培養時取荷花種胚的方法以及消毒的方法，郭娜娜等(荷花成熟胚的組織培養[J].河南科學,2013(3):281-284.)使用濃硫酸腐蝕蓮子種皮，用小刀破殼后直接用酒精和氯化汞消毒后成熟胚的離體成活率達到86.63％，最終可以形成無菌苗。另一種途徑則是通過體細胞胚胎發生途徑，即先通過誘導外植體形成胚性愈傷，進一步誘導胚性愈傷發育成成熟的胚狀體并萌發成完整植株，此過程類似于植物的有性繁殖，體細胞胚胎發生途徑的困難在于，胚性愈傷與胚狀體的誘導與增殖周期長，獲得難度大且有基因型的差異，但因為它在以下方面的幾個特點使這項技術極具吸引力：一、一旦成功誘導出胚性愈傷，它可以獲得幾百倍甚至上千倍的增殖系數；二，胚性愈傷可以長期保持；三、體細胞胚被認為是單細胞起源，在遺傳轉化過程中不易形成嵌合體導致假陽性的發生，因此是轉基因的良好受體。在荷花上，目前尚未見體細胞胚胎再生途徑方面的報道。現有技術中荷花作為商業開發時，利用種藕進行人工繁育的繁殖系數低、成本高；同時在基礎研究中缺乏高效的再生體系，限制了基因工程育種工作的開展；這些因素不利于荷花的經濟栽培與遺傳育種工作。因此，通過研究獲得一種荷花的高效再生體系，以解決荷花人工胚狀體的獲取、基因工程育種等問題，并實現荷花的人工快速離體培養與再生，這顯得尤為重要。
技術實現思路
鑒于現有技術的不足，本專利技術的目的在于提供一種荷花的未成熟子葉體細胞胚誘導、增殖、分化、萌發與成苗方法，以實現荷花的快速經濟繁育，極大提高荷花的繁育系數，同時本專利技術得到的再生體系可以為荷花的基因工程育種提供良好的材料基礎。為了實現本專利技術的上述目的，專利技術人通過大量試驗研究并不懈探索，最終獲得了一種荷花未成熟子葉體細胞胚胎發生途徑的再生方法，該方法包括利用外植體誘導進行組織培養的步驟，所采用的外植體為荷花合子胚中的未成熟子葉。進一步地，本專利技術所提供的荷花未成熟子葉體細胞胚胎發生途徑的再生方法，該方法包括如下步驟：(1)選取荷花受精后合子胚中的未成熟子葉作為組織培養的外植體，對外植體進行消毒及清潔處理；(2)將外植體放入胚性愈傷誘導與增殖培養基中培養，誘導出愈傷組織并進行增殖培養；(3)將愈傷組織塊轉移到胚狀體發生培養基中，發育形成胚狀體；(4)將產生的胚狀體移入胚萌發培養基中進行萌發，發育形成子葉形胚；(5)將萌發的子葉形胚移至含荷花成苗培養基中成苗培養，然后移栽至自然環境中。優選地，如上所述荷花未成熟子葉體細胞胚胎發生途徑的再生方法，其中步驟(1)中對于發育較大的未成熟子葉，將其切割成約1-2mm小塊。優選地，如上所述荷花未成熟子葉體細胞胚胎發生途徑的再生方法，其中步驟(2)中所述的胚性愈傷誘導與增殖培養基的配方為基本MS培養基，添加30g/L的蔗糖、250mg/L的水解酪蛋白、0.5-5.0mg/L的2,4-D、0.5-2.0mg/L的BAP和0.7％的瓊脂糖，調節pH為5.5-6.0；外植體放在盛有上述培養基的培養皿中，然后用封口膜將培養皿包好；培養條件為黑暗或弱光中，25±2℃培養4-8周；當愈傷組織誘導出來，將胚性愈傷組織分成直徑為0.2-0.5cm的小塊，將各小塊分別接入裝有所述胚性愈傷誘導與增殖培養基的器皿中進行胚性愈傷組織的增殖。優選地，如上所述荷花未成熟子葉體細胞胚胎發生途徑的再生方法，其中步驟(3)中所述的胚狀體發生培養基的配方為基本MS培養基，添加30g/L的蔗糖、250mg/L的水解酪蛋白、1.0mg/L的BAP和0.7％的瓊脂糖，調節pH為5.5-6.0；將步驟2所得的胚性愈傷組織接入盛有上述培養基的培養皿中，然后用封口膜將培養皿包好；培養條件為16/8h光周期，光照強度為1000-1500lux，25±2℃培養3-4周。優選地，如上所述荷花未成熟子葉體細胞胚胎發生途徑的再生方法，其中步驟(4)中所述的胚萌發培養基的配方為1/2MS培養基，添加10-50mg/L的GA3、0-0.5mg/L的BAP與0.7％的瓊脂糖；培養條件為16/8h光周期，光照強度為2000-3000lux，25±2℃培養1-6周。優選地，如上所述荷花未成熟子葉體細胞胚胎發生途徑的再生方法，其中步驟(5)中所述的荷花成苗培養基為雙層培養基，基中下層為固體培養基，上層為液體培養基，固體培養基的配方為1/2MS培養基，添加0.2mg/L的IBA與0.7％的瓊脂糖，液體培養基的配方為2％蔗糖水溶液，調節pH為5.5-6.0。進一步優選地，如上所述荷花未成熟子葉體細胞胚胎發生途徑的再生方法，其中步驟(5)中當荷花莖伸長至6-8cm后，將其移栽至泥塘中培養。與現有技術相比，本專利技術的荷花未成熟子葉體細胞胚胎發生途徑的再生方法具有如下有益效果和突出優點：其一，培養速度快，從誘導傷愈組織6-8個星期之后，胚性愈傷組織開始形成，8-10個星期之后胚形態已經開始發生并形成子葉形胚，然后將已誘導的小苗進行移栽，可進一步培養成苗；其二，經濟適用性高，每克愈傷組織可以分化成500-800個胚狀體或者不斷在新愈傷培養基上擴大培養，這取決于材料、培養基與激素的應用，一般而言通過3-4周的培養可以擴大8-10倍；其三，能促進荷花的商業開發，有效提高荷花生產上的繁殖系數，滿足園藝栽培與大批量生產的要求；其四，荷花的轉基因研究剛剛起步，本專利技術中建立的高效再生體系可以為荷花的轉基因奠定良好的基礎；其五，本專利技術的方法易于實施，便于推廣。附圖說明圖1為荷花品種‘紅建蓮’體細胞胚胎發生過程；其中：a.花后10d未成熟合子胚子葉接種42d后形成的愈傷；b.胚性愈傷的增殖(黑色部分為老愈傷組織，淡黃色部分為新形成的愈傷)；c.體細胞胚的萌發(多個體細胞胚發育本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種荷花體細胞胚胎發生途徑的再生用胚性愈傷誘導與增殖培養基，其特征在于，該培養基的配方為基本MS培養基，添加30g/L的蔗糖、250mg/L的水解酪蛋白、0.5?5.0mg/L的2,4?D、0.5?2.0mg/L的BAP和0.7％的瓊脂糖，調節pH為5.5?6.0。

【技術特征摘要】
1.一種荷花體細胞胚胎發生途徑的再生用胚性愈傷誘導與增殖培養基，其特征在于，該培養基的配方為基本MS培養基，添加30g/L的蔗糖、250mg/L的水解酪蛋白、0.5-5.0mg/L的2,4-D、0.5-2.0mg/L的BAP和0.7％的瓊脂糖，調節pH為5.5-6.0。2.根據權利要求1所述荷花體細胞胚胎發生途徑的再生用胚性愈傷誘導與增殖培養基，其特征在于，該培養基培養的外植體為荷花合子胚...

【專利技術屬性】
技術研發人員：方林川，李紹華，
申請(專利權)人：武漢市農業科學技術研究院林業果樹科學研究所，
類型：發明
國別省市：湖北,42