一種穩(wěn)定表達雞BCRP轉(zhuǎn)運體的MDCK細胞模型及其構(gòu)建方法與應用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種穩(wěn)定表達雞BCRP轉(zhuǎn)運體的MDCK細胞模型及其構(gòu)建方法與應用。該細胞模型的名稱為MDCK?chBCRP；制備方法為構(gòu)建含雞BCRP慢病毒的表達載體，轉(zhuǎn)染293T細胞得到含雞BCRP的慢病毒，再感染MDCK細胞，經(jīng)含1μg/mL的嘌呤霉素培養(yǎng)液篩選后得到穩(wěn)定表達雞BCRP轉(zhuǎn)運體的MDCK細胞模型。本發(fā)明專利技術(shù)的細胞模型可用于快速篩選雞BCRP底物，在禽類藥物開發(fā)上有很好的應用前景。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
一種穩(wěn)定表達雞BCRP轉(zhuǎn)運體的MDCK細胞模型及其構(gòu)建方法與應用
本專利技術(shù)屬于細胞工程
，涉及一種穩(wěn)定表達雞BCRP轉(zhuǎn)運體的MDCK細胞模型及其構(gòu)建方法與應用。
技術(shù)介紹
乳腺癌耐藥蛋白(Breastcancerresistanceprotein,BCRP)是由Doyle等從阿霉素抗性的MCF-7乳腺癌細胞MCF-7/AdrVP中首先克隆得到的，是ATP結(jié)合盒(ATP-bindingcassette,ABC)轉(zhuǎn)運體家族中G亞族的2號成員,因此也命名為ABCG2。BCRP蛋白主要分布在具有分泌和排泄功能的組織中，比如小腸、肝臟、胎盤和血腦屏障上的表達水平都比較高。BCRP可以有效地外排眾多的外源物質(zhì)，包括常用的獸藥，這在維持機體穩(wěn)態(tài)的同時也限制了眾多口服藥物的吸收。因此，BCRP作為一種高效的外排泵在藥物體內(nèi)的吸收、分布、排泄等過程中發(fā)揮著重要作用。目前，藥物在轉(zhuǎn)運體層面的相互作用已被認為是引起代謝性藥物相互作用的重要原因之一，F(xiàn)DA最新指導原則指出所有藥物必須進行藥物轉(zhuǎn)運體的檢測分析。但是原代細胞來源困難，不易培養(yǎng)，且同時表達多種外排蛋白，因此采用建立轉(zhuǎn)基因細胞系的方法可以專一性地研究藥物與特定蛋白的相互作用，從而排除其他干擾。在動物臨床用藥中，小腸部位的跨膜吸收是口服藥物進入細胞內(nèi)的第一道屏障，這也是影響藥物療效的重要因素之一。MDCK(Madin-Darbycaninekidney)細胞系是以馬丁達比犬腎上皮細胞為原型，演變得到的一種細胞間具有緊密連接，且自身內(nèi)源性轉(zhuǎn)運蛋白和代謝酶活性較低的細胞系。因MDCK細胞與小腸上皮細胞生理特性類似，而常用于體外藥物吸收特性的研究，且MDCK細胞培養(yǎng)周期較短，可以更快速的用于抑制劑的篩選及底物的鑒定。因此將BCRP導入MDCK細胞系中，可建立一個理想的細胞模型，用于快速篩選BCRP的底物，從而預測所研究的分子化合物在體內(nèi)可能的吸收、分布和消除情況。
技術(shù)實現(xiàn)思路
針對現(xiàn)有技術(shù)問題，本專利技術(shù)的目的在于提供一種穩(wěn)定表達雞BCRP轉(zhuǎn)運體的MDCK細胞模型及其構(gòu)建方法與應用，該細胞模型可快速篩選BCRP的底物，更準確預測所研究的分子化合物在體內(nèi)的代謝情況。為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，本專利技術(shù)采取的技術(shù)方案為：一種穩(wěn)定表達雞BCRP轉(zhuǎn)運體的MDCK細胞模型，是先構(gòu)建含雞BCRP的慢病毒表達載體，轉(zhuǎn)染293T細胞得到含雞BCRP的慢病毒，再感染MDCK細胞，經(jīng)含1μg/mL的嘌呤霉素培養(yǎng)液篩選后得到穩(wěn)定表達雞BCRP轉(zhuǎn)運體的MDCK細胞模型，即MDCK-chBCRP。上述穩(wěn)定表達雞BCRP轉(zhuǎn)運體的MDCK細胞模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：步驟1，構(gòu)建含雞BCRP的慢病毒表達載體從雞新鮮的腸道組織提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR獲得cDNA序列；通過設計含有EcoRI和BamHI兩個酶切位點的特異性引物以上述cDNA為模板特異性擴增得到目的基因；通過EcoRI和BamHI兩個酶切位點雙酶切慢病毒表達載體Lenti-III-RFP-C以得到線性化的載體；將目的基因與線性化慢病毒表達載體通過EcoRI和BamHI兩個酶切位點連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a中，得到含雞BCRP的慢病毒表達載體Lenti-III-RFP-C-BCRP；步驟2，轉(zhuǎn)染293T細胞將含雞BCRP的慢病毒表達載體Lenti-III-RFP-C-BCRP與包裝質(zhì)粒pLenti-P2A、pLenti-P2B組成三質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)共同轉(zhuǎn)染293T細胞，于37℃、5％CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8-14h后，換成完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48h后收集培養(yǎng)液，過濾離心后得到濃縮的慢病毒，并于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆茫徊襟E3，慢病毒感染MDCK細胞：培養(yǎng)MDCK細胞至融合度50％-60％，加入步驟2所得的慢病毒，感染72h后，胰酶消化細胞重新接種于24孔板中培養(yǎng)至融合度40％，然后在培養(yǎng)基中加入1.0μg/ml的嘌呤霉素進行抗性篩選，持續(xù)篩選2周后，收集感染細胞，備用；步驟4，單克隆篩選將步驟3所得的感染細胞稀釋至密度為1000cell/ml的單細胞懸液，并接種于96孔板的第一列，0.2ml/孔，從第一列吸取0.1mL單細胞懸液接種于第二列并加入0.1mL培養(yǎng)液混合，從第二列中吸取0.1mL接種于第三列并加入0.1mL培養(yǎng)液混合，一直到最后一列，再將最后一列的細胞放于顯微鏡下觀察，挑選出只有單個細胞的孔并做好標記，待單個細胞長成細胞團后，挑選出生長較好的單克隆細胞團，移到24孔板作擴大培養(yǎng)，分別取樣裂解細胞，并逐個進行RT-qPCR檢測，挑選出過表達效果最好的一孔，再將其擴大培養(yǎng)成穩(wěn)定細胞模型；步驟5，驗證對步驟4的細胞模型通過WesternBlot和熒光檢測的方法進行蛋白表達的驗證，通過對BCRP經(jīng)典底物米托蒽醌的敏感性及蓄積能力進行蛋白功能的確證。作為改進的是，步驟1中特異性引物為：BCRP-FP:GAGAATTCGCCACCATGGGAACTGCTCAAAACAACAG；BCRP-RP:CAGGATCCTGTGAACTTCCTCATAAACCGGAG。作為改進的是，步驟2轉(zhuǎn)染293T細胞包括以下步驟：第一步，將1.3-1.5×106的293T細胞接種到10厘米細胞培養(yǎng)板中，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，待細胞達到70-80％融合度時進行轉(zhuǎn)染備用；第二步，取兩個1.5mL離心管，其中一個離心管加入1mL無血清培養(yǎng)基、10μg慢病毒表達載體Lenti-III-RFP-C-BCRP慢病毒表達質(zhì)粒、10μg的慢病毒包裝質(zhì)粒pLenti-P2A和pLenti-P2B，混勻，室溫孵育5min；另一個離心管中將80μL的Lentifectin轉(zhuǎn)染試劑稀釋到1mL無血清培養(yǎng)基中，混勻，室溫孵育5min；兩管混勻，室溫孵育20min后再加入4.5mL的無血清培養(yǎng)基，即得到混勻的DNA-LentiFectin復合物；將準備好的包裝細胞293T中的培養(yǎng)基吸掉，加入DNA-LentiFectin復合物，輕柔渦旋平板使復合物分散，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)8-14h后，加入新鮮完全培養(yǎng)液更換舊培養(yǎng)液；轉(zhuǎn)染48h后收集培養(yǎng)基，用0.45μm濾膜過濾該培養(yǎng)基得到純化的病毒液，離心收集病毒顆粒，獲得濃縮的慢病毒，并于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｉ鲜鲆环N穩(wěn)定表達雞BCRP轉(zhuǎn)運體的MDCK細胞模型在快速篩選BCRP蛋白的底物上的應用。作為改進的是，上述應用包括以下步驟：MDCK和MDCK-chBCRP細胞分別在transwell小室里長成完整致密的單層細胞，先用HBSS緩沖液孵育單層細胞30min，然后在不同transwell小室頂側(cè)或基底側(cè)加入待測藥物繼續(xù)孵育，藥物孵育4h后收集接受室內(nèi)的液體并檢測轉(zhuǎn)運的藥物濃度，分別計算被測藥物在MDCK和MDCK-chBCRP細胞上的表觀滲透系數(shù)和外排率，以及藥物的凈外排率，如果凈外排率大于2，則待測藥物是BCRP的底物。有益效果(1)通過慢病毒轉(zhuǎn)染這種技術(shù)建立的MDCK-chBCRP的細胞系可永久化的穩(wěn)定高表達BCRP蛋白，避免了隨著時間的延長丟失外源基因的發(fā)生；(2)該細胞系易培養(yǎng)，增殖速度快，可無限擴大，性質(zhì)穩(wěn)定，可作為快速篩選BCRP底物的研究模型；(3)可應用MDCK-chBCRP細胞模型預測有BCRP介導的藥物—本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種穩(wěn)定表達雞BCRP轉(zhuǎn)運體的MDCK細胞模型，其特征在于：是先構(gòu)建含雞BCRP的慢病毒表達載體，轉(zhuǎn)染293T細胞得到含雞BCRP的慢病毒，再感染MDCK細胞，經(jīng)含1?μg/mL?的嘌呤霉素培養(yǎng)液篩選后得到穩(wěn)定表達雞BCRP轉(zhuǎn)運體的MDCK細胞模型，即MDCK?chBCRP。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種穩(wěn)定表達雞BCRP轉(zhuǎn)運體的MDCK細胞模型，其特征在于：是先構(gòu)建含雞BCRP的慢病毒表達載體，轉(zhuǎn)染293T細胞得到含雞BCRP的慢病毒，再感染MDCK細胞，經(jīng)含1μg/mL的嘌呤霉素培養(yǎng)液篩選后得到穩(wěn)定表達雞BCRP轉(zhuǎn)運體的MDCK細胞模型，即MDCK-chBCRP。2.基于權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定表達雞BCRP轉(zhuǎn)運體的MDCK細胞模型的構(gòu)建方法，其特征在于：包括以下步驟：步驟1，構(gòu)建含雞BCRP的慢病毒表達載體從雞新鮮的腸道組織提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR獲得cDNA序列；通過設計含有EcoRI和BamHI兩個酶切位點的特異性引物以上述cDNA為模板特異性擴增得到目的基因；通過EcoRI和BamHI兩個酶切位點雙酶切慢病毒表達載體Lenti-III-RFP-C以得到線性化的載體；將目的基因與線性化慢病毒表達載體通過EcoRI和BamHI兩個酶切位點連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a中，得到含雞BCRP的慢病毒表達載體Lenti-III-RFP-C-BCRP；步驟2，轉(zhuǎn)染293T細胞將含雞BCRP的慢病毒表達載體Lenti-III-RFP-C-BCRP與包裝質(zhì)粒pLenti-P2A、pLenti-P2B組成三質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)共同轉(zhuǎn)染293T細胞，于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8-14h后，換成完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48h后收集培養(yǎng)液，過濾離心后得到濃縮的慢病毒，并于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆茫徊襟E3，慢病毒感染MDCK細胞培養(yǎng)MDCK細胞至融合度50%-60%，加入步驟2所得的慢病毒，感染72h后，胰酶消化細胞重新接種于24孔板中培養(yǎng)至融合度40%，然后在培養(yǎng)基中加入1.0μg/ml的嘌呤霉素進行抗性篩選，持續(xù)篩選2周后，收集感染細胞，備用；步驟4，單克隆篩選將步驟3所得的感染細胞稀釋至密度為1000cell/ml的單細胞懸液，并接種于96孔板的第一列，0.2ml/孔，從第一列吸取0.1mL單細胞懸液接種于第二列并加入0.1mL培養(yǎng)液混合，從第二列中吸取0.1mL接種于第三列并加入0.1mL培養(yǎng)液混合，一直到最后一列，再將最后一列的細胞放于顯微鏡下觀察，挑選出只有單個細胞的孔并做好標記，待單個細胞長成細胞團后，挑選出生長較好的單克隆細胞團，移到24孔板作擴大培養(yǎng)，分別取樣裂解細胞，并逐個進行RT-qPCR檢測，挑選出過表達效果最好的一孔，再將其擴大培養(yǎng)成穩(wěn)定細胞模型；步驟5，驗證對步驟4的細胞模型通過WesternBlot和...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王麗平，張瑜娟，黃金虎，
申請(專利權(quán))人：南京農(nóng)業(yè)大學，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇,32