無T?DNA整合的農桿菌介導的基因組修飾制造技術

本文描述用于基因組工程改造的方法，包括采用修飾的轉移DNA(T?DNA)質粒利用核酸酶的瞬時表達的方法。

No Agrobacterium mediated genomic integration of T DNA modification

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】無T-DNA整合的農桿菌介導的基因組修飾相關申請的交叉引用本申請要求2015年2月2日提交的美國臨時申請系列號62/110,735的優先權，其通過引用其全文納入本文。
本專利技術涉及用于基因組工程改造的方法，包括通過利用修飾的轉移DNA(T-DNA)質粒的核酸酶的瞬時表達進行基因組工程改造的方法。技術背景革蘭氏陰性細菌類的農桿菌(Agrobacterium)利用水平基因轉移來造成植物中的腫瘤生成，其通過大腫瘤誘導型(Ti)或根系發生(Ri)質粒將轉移DNA(T-DNA)引入植物基因組來進行。為了具有毒力，農桿菌必須包含具有T-DNA和將該T-DNA轉移至植物細胞并將其整合進入染色體DNA所需的全部基因的Ti或Ri質粒。盡管Ti和Ri質粒均存在多種變化形式，在天然產生的菌株中常見幾種特征：毒力基因、復制起點、冠癭堿(opine)分解代謝基因、右邊界(RB)序列、左邊界(LB)序列，和轉移DNA(T-DNA)區域。毒力基因和邊界序列允許農桿菌通過IV型分泌系統(TIVSS)將所述T-DNA轉移進入植物細胞。一旦T-DNA被轉化進入植物細胞，其能夠在農桿菌毒力蛋白的協助下整合進入宿主基因組。該整合的T-DNA可包含致癌基因和冠癭堿合成基因，其允許增加冠癭堿的產量，該物質作為農桿菌的碳源和氮源。Ti和Ri質粒在核苷酸水平上顯著不同，而所述質粒可在根癌農桿菌(A.tumefaciens)和毛根農桿菌(A.rhizogenes)之間互換，因此使所述細菌具有指示其所包含的Ti或Ri質粒的新病原性特征。農桿菌T-DNA可被修飾并用于二元載體系統，其中，毒力基因和T-DNA在分開的質粒上。該策略已被用于將新基因引入植物基因組(參見例如，Lee和Gelvin，PlantPhysiol146：325-332，2008)。認為Ti或Ri質粒上的毒力基因和許多農桿菌染色體基因是整合機制所必需的。然而，整合機制尚未被完全闡明。
技術實現思路
本文部分基于如下發現：農桿菌介導的轉化可用于植物細胞中序列特異性核酸酶的瞬時表達，以產生非轉基因的遺傳修飾的植物。例如，農桿菌可用于將編碼所需核酸酶基因的T-DNA引入植物細胞，以允許核酸酶在無T-DNA整合的情況下表達。所述核酸酶的瞬時表達可導致定點基因組修飾，使得對所選植物物種的準確工程改造成為可能。這可消除對于后續回交以移除通過傳統農桿菌轉化整合的外來DNA的需求，減少了調控方面的問題，并加快了推向市場的速度。本文特別提供一種在植物細胞中瞬時表達多肽的方法。所述方法可包括：將包含T-DNA區域的修飾的Ti、Ri或T-DNA質粒引入植物細胞，所述T-DNA區域包括：(a)T-DNA邊界序列，和(b)包含5′啟動子區域的多肽編碼序列、編碼多肽的結構編碼序列，和編碼聚腺苷酸化信號的3′非翻譯區域，其中所述5′啟動子區域和所述3′非翻譯區域操作性地連接至所述結構編碼序列，從而所述多肽編碼序列在所述植物細胞中瞬時表達且不整合進入所述植物細胞的基因組。例如，所述方法可包括，將抑制整合的T-DNA(iiT-DNA)質粒引入細胞，所述抑制整合的T-DNA(iiT-DNA)質粒對應于Ti、Ri和T-DNA質粒，其已通過移除或失活至少一個T-DNA邊界而被修飾的，從而減少所得iiT-DNA的整合。在一些實施方式中，修飾的Ti質粒、Ri質粒或T-DNA質粒的LB被移除或失活，從而破壞了T-DNA向植物基因組中的整合。修飾的Ti、Ri或T-DNA質粒可具有至少一個非功能性的T-DNA邊界序列(例如，可僅具有一個功能性T-DNA邊界序列，或可沒有功能性T-DNA邊界序列)。在一些實施方式中，一旦該iiT-DNA進入植物細胞，則使iiT-DNA質粒的RB(不含LB或失活的LB)成為可移除的或失活的，從而進一步破壞T-DNA整合。在所述實施方式中，所述質粒在本文中稱為可移除的右邊界iiT-DNA(RRBiiT-DNA)質粒。如本文所述，RRBiiT-DNA可通過切點罕見核酸內切酶移除RB序列來獲得。一般而言，切點罕見核酸內切酶可由修飾的Ti、Ri或T-DNA質粒中包含的T-DNA序列中包括的結構編碼序列之一編碼。本專利技術還提供一種在無T-DNA整合的情況下，采用如本文所述的修飾的Ti、Ri或T-DNA質粒在植物細胞中進行基因編輯的方法，其中切點罕見核酸內切酶從所述質粒瞬時表達。所述切點罕見核酸內切酶可導向針對植物基因組中的特定基因座，從而其作用可導致位于該特定基因座處的遺傳序列的突變、修飾或修復。在一些實施方式中，方法可包括向所述細胞引入(或使細胞接觸)能夠進行水平基因轉移的生物體，其中所述生物體包含所述修飾的Ti、Ri或T-DNA質粒。在本文提供的方法中，所述能夠進行水平基因轉移的生物體可以是細菌(例如，農桿菌)。T-DNA邊界序列可來自農桿菌。上述iiT-DNA邊界序列可以是T-DNARB序列(例如，來自真蛸堿Ti質粒、胭脂堿Ti質粒或農桿堿Ti質粒的RB序列)。iiT-DNA邊界序列可以是Ti或Ri質粒中的多肽編碼序列的5′。5′啟動子區域可天然存在于植物細胞中，或可能能夠天然進入植物細胞。所述5′啟動子區域可包括組成型啟動子，或所述5′啟動子區域可包括誘導型啟動子，并且所述方法還可包括誘導所述啟動子。多肽編碼序列可編碼切點罕見核酸內切酶或切點罕見核酸內切酶亞基。切點罕見核酸內切酶可以是轉錄激活因子樣(TAL)效應物核酸內切酶(也稱為TALE核酸酶或)、鋅指核酸酶、大范圍核酸酶，或可編程的RNA導向的核酸內切酶。所述切點罕見核酸內切酶的瞬時表達可導致定點誘變。所述修飾的Ti、Ri或T-DNA質粒可包含報告基因，其采用所述結構編碼序列瞬時表達。報告基因的表達可導致視覺信號或抗生素抗性。T-DNA區域還可包括供體序列。供體序列向所述細胞的瞬時遞送可導致基因靶向。所述T-DNA區域還可包含第二多肽編碼序列，其具有5′啟動子區域、編碼第二多肽的結構編碼序列，和編碼聚腺苷酸化信號的3′非翻譯區域，其中所述5′啟動子區域和所述3′非翻譯區域操作性地連接至所述結構編碼序列，從而第二多肽編碼序列在所述植物細胞中瞬時表達且不整合進入所述植物細胞的基因組。第二多肽編碼序列的5′啟動子區域可天然存在于植物細胞或可能能夠天然進入植物細胞。所述5′啟動子區域可包括組成型啟動子，或所述5′啟動子區域可包括誘導型啟動子，并且所述方法還可包括誘導所述啟動子。所述多肽編碼序列可編碼切點罕見核酸內切酶(例如，TAL效應物核酸內切酶、鋅指核酸酶、大范圍核酸酶，或可編程的RNA導向的核酸內切酶)或切點罕見核酸內切酶亞基，并且第二多肽編碼序列可編碼切點罕見核酸內切酶或切點罕見核酸內切酶亞基。所述切點罕見核酸內切酶或切點罕見核酸內切酶亞基的瞬時表達可導致定點誘變。所述T-DNA還可包含重復且反向的序列。例如，所述T-DNA可在該T-DNA邊界序列的約1000核苷酸之內包括重復且反向的序列，例如該T-DNA邊界序列的約500～1000核苷酸之內、該T-DNA邊界序列的約250～500核苷酸之內，或該T-DNA邊界序列的約1～500核苷酸之內。在一些實施方式中，所述重復且反向的序列可位于邊界序列處，從而該重復的序列包含邊界(例如，邊界因突變而變得非本文檔來自技高網...

【技術保護點】
在植物細胞中瞬時表達多肽的方法，所述方法包括將修飾的Ti、Ri或T?DNA質粒引入所述植物細胞，其中，所述修飾的Ti、Ri或T?DNA質粒包含T?DNA區域，該T?DNA區域包含：(a)T?DNA邊界序列；和(b)包含5′啟動子區域的多肽編碼序列、編碼所述多肽的結構編碼序列，和包含聚腺苷酸化信號的3′非翻譯區域，其中，所述5′啟動子區域和所述3′非翻譯區域操作性地連接至所述結構編碼序列，從而所述多肽編碼序列在所述植物細胞中瞬時表達且不整合進入所述植物細胞的基因組。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2015.02.02 US 62/110,7351.在植物細胞中瞬時表達多肽的方法，所述方法包括將修飾的Ti、Ri或T-DNA質粒引入所述植物細胞，其中，所述修飾的Ti、Ri或T-DNA質粒包含T-DNA區域，該T-DNA區域包含：(a)T-DNA邊界序列；和(b)包含5′啟動子區域的多肽編碼序列、編碼所述多肽的結構編碼序列，和包含聚腺苷酸化信號的3′非翻譯區域，其中，所述5′啟動子區域和所述3′非翻譯區域操作性地連接至所述結構編碼序列，從而所述多肽編碼序列在所述植物細胞中瞬時表達且不整合進入所述植物細胞的基因組。2.如權利要求1所述的方法，其中，所述修飾的Ti、Ri或T-DNA質粒包含至少一個非功能性的T-DNA邊界序列。3.如權利要求1所述的方法，其中，所述修飾的Ti、Ri或T-DNA質粒僅包含一個功能性T-DNA邊界序列。4.如權利要求1所述的方法，其中，所述修飾的Ti、Ri或T-DNA質粒不包含任何功能性T-DNA邊界序列。5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中，所述修飾的Ti、Ri或T-DNA質粒不包含右邊界序列。6.如權利要求1所述的方法，其中，所述引入步驟包含使易感植物細胞與能夠進行水平基因轉移的生物體接觸。7.如權利要求6所述的方法，其中，所述能夠進行水平基因轉移的生物體是細菌。8.如權利要求2所述的方法，其中，所述細菌是農桿菌(Agrobacterium)。9.如權利要求1所述的方法，其中，所述T-DNA邊界序列來自農桿菌。10.如權利要求1所述的方法，其中，所述T-DNA邊界序列是T-DNA右邊界序列。11.如權利要求1所述的方法，其中，所述T-DNA邊界序列來自真蛸堿Ti質粒、胭脂堿Ti質粒，或農桿堿Ti質粒。12.如權利要求1所述的方法，其中，所述T-DNA包含重復且反向的序列。13.如權利要求12所述的方法，其中，所述重復且反向的序列與所述邊界序列毗連。14.如權利要求1所述的方法，其中，所述T-DNA邊界序列是所述修飾的Ti、Ri或T-DNA質粒中的多肽編碼序列的5′。15.如權利要求1所述的方法，其中，所述5′啟動子區域天然存在于植物細胞中或能夠天然進入植物細胞。16.如權利要求1所述的方法，其中，所述5′啟動子區域包含組成型啟動子。17.如權利要求1所述的方法，其中，所述5′啟動子區域包含誘導型啟動子，并且其中，所述方法還包括誘導所述啟動子。18.如權利要求1所述的方法，其中，所述多肽編碼序列編碼切點罕見核酸內切酶或切點罕見核酸內切酶亞基。19.如權利要求18所述的方法，其中，所述切點罕見核酸內切酶是轉錄激活因子樣(TAL)效應物核酸內切酶、鋅指核酸酶、大范圍核酸酶，或可編程的RNA導向的核酸內切酶。20.如權利要求18所述的方法，其中所述切點罕見核酸內切酶的瞬時表達導致定點誘變。21.如權利要求1所述的方法，其中，所述修飾的Ti、Ri或T-DNA質粒包含與所述結構編碼序列瞬時表達的報告基因。22.如權利要求21所述的方法，其中所述報告基因的表達導致視覺信號或抗生素抗性。23.如權利要求1所述的方法，其中，所述T-DNA區域還包含供體序列。24.如權利要求23所述的方法，其中所述供體序列的瞬時遞送導致基因靶向。25.如權利要求1所述的方法，其中，所述T-DNA區域還包含含有5′啟動子區域的第二多肽編碼序列，編碼第二多肽的結構編碼序列，和編碼聚腺苷酸化信號的3′非翻譯區域，其中，所述5′啟動子區域和所述3′非翻譯區域操作性地連接至所述結構編碼序列，從而第二多肽編碼序列在所述植物細胞中瞬時表達且不整合進入所述植物細胞的基因組。26.如權利要求25所述的方法，其中，第二多肽編碼序列的5′啟動子區域天然存在于植物細胞中或能夠天然進入植物細胞。27.如權利要求25所述的方法，其中，第二多肽編碼序列的5′啟動子區域包含組成型啟動子。28.如權利要求25所述的方法，其中，第二多肽編碼序列的5′啟動子區域包含誘導型啟動子，并且其中，所述方法還包括誘導所述啟動子。29.如權利要求25所述的方法，其中，所述多肽編碼序列編碼切點罕見核酸內切酶或切點罕見核酸內切酶亞基，并且第二多肽編碼序列編碼切點罕見核酸內切酶或切點罕見核酸內切酶亞基。30.如權利要求29所述的方法，其中，所述切點罕見核酸內切酶是TAL效應物核酸內切酶、鋅指核酸酶、大范圍核酸酶，或可編程的RNA導向的核酸內切酶。31.如權利要求29所述的方法，其中所述切點罕見核酸內切酶或切點罕見核酸內切酶亞基的瞬時表達導致定點誘變。32.一種產生植物的方法，包括，提供根據如權利要求1所述的方法獲得的植物細胞，其中，所述多肽編碼序列編碼切點罕見核酸內切酶或切點罕見核酸內切酶亞基，和，使所述植物細胞再生成植物。33.如權利要求32所述的方法，其中，所述再生的植物包含由所述切點罕見核酸內切酶的瞬時表達產生的一個或多個突變。34.一種產生植物的方法，包括，提供根據如權利要求25所述的方法獲得的植物細胞，其中，所述多肽編碼序列編碼切點罕見核酸內切酶或切點罕見核酸內切酶亞基，并且第二多肽編碼序列編碼切點罕見核酸內切酶或切點罕見核酸內切酶亞基，和，使所述植物細胞再生成植物。35.如權利要求34所述的方法，其中，所述再生的植物包含由所述切點罕見核酸內切酶或切點罕見核酸內切酶亞基的瞬時表達產生的一個或多個突變。36.在植物細胞中瞬時表達多肽的方法，所述方法包括，將能夠進行水平基因轉移的生物體引入植物細胞，其中，所述生物體包含含有T-DNA區域的修飾的Ti、Ri或T-DNA質粒，所述T-DNA區域包含：(a)T-DNA邊界序列；(b)切點罕見核酸內切酶的靶位點；和(c)包含5′啟動子區域的多肽編碼序列、編碼所述多肽的結構編碼序列，和包含聚腺苷酸化信號的3′非翻譯區域，其中，所述5′啟動子區域和所述3′非翻譯區域操作性地連接至所述結構編碼序列，從而所述多肽編碼序列在所述植物細胞中瞬時表達且不整合進入所述植物細胞的基因組。37.如權利要求36所述的方法，其中，所述能夠進行水平基因轉移的生物體是細菌。38.如權利要求37所述的方法，其中，所述細菌是農桿菌(Agrobacterium)。39.如權利要求36所述的方法，其中，所述T-DNA邊界序列來自農桿菌。40.如權利要求36所述的方法，其中，所述T-DNA邊界序列是T-DNA右邊界序列。41.如權利要求36所述的方法，其中，所述T-DNA邊界序列來自真蛸堿Ti質粒、胭脂堿Ti質粒，或農桿堿Ti質粒。42.如權利要求36所述的方法，其中，所述T-DNA邊界序列是所述修飾的Ti、Ri或T-DNA質粒中的多肽編碼序列的5′。43.如權利要求36所述的方法，其中，所述5′啟動子區域天然存在于植物細胞或能夠天然進入植物細胞。44.如權利要求36所述的方法，其中，所述5′啟動子區域包含組成型啟動子。45.如權利要求36所述的方法，其中，所述5′啟動子區域包含誘導型啟動子，并且其中，所述方法還包括誘導所述啟動子。46.如權利要求36所述的方法，其中，所述多肽編碼序列編碼切點罕見核酸內切酶或切點罕見核酸內切酶亞基。47.如權利要求46所述的方法，其中，所述切點罕見核酸內切酶是TAL效應物核酸內切酶、鋅指核酸酶、大范圍核酸酶，或可編程的RNA導向的核酸內切酶。48.如權利要求46所述的方法，其中所述切點罕見核酸內切酶的瞬時表達導致定點誘變。49.如權利要求36所述的方法，其中，所述T-DNA區域還包...

【專利技術屬性】
技術研發人員：T·斯托達德，N·J·巴特斯，羅松，
申請(專利權)人：塞爾克蒂斯股份有限公司，
類型：發明
國別省市：法國,FR