以中藥材為主原料制備基因工程多肽藥物的方法技術

一種基因工程多肽藥物，它是以改造過的中醫藥驗方，秘方為基礎，以中藥材動植物細胞為主要原料，通過建立基因庫，ＤＮＡ、ＲＮＡ的提取、大腸桿菌或雙歧桿菌或乳酸桿菌與真菌雜交形成的新的微生物基因的質粒ＤＮＡ的提取，進行重組，克隆制備而成的基因工程多肽藥物。這種基因工程多肽藥物不但具有生物活性，而且其小分子蛋白保持原有的抗原性。這種多肽藥物不但含有３８％以上的活性多糖，而且還含有６％以上的亞麻酸，１４％以上的小分子蛋白和游離氨基酸。本品是一種療效很高、營養價值很高的免疫調節劑或免疫再生劑，它對治療艾滋病１期－５期具有顯著療效。（*該技術在2018年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及利用基因工程重組、克隆技術生產具有中藥的安全性，西藥的高效性和生物醫藥的活性的基因工程多肽藥物。特別是涉及到一種免疫調節劑、免疫再生劑，以及通過基因重組、克隆方法生產抗艾滋病藥物的技術。據WHO公布的數字表明，全世界HIV陽性帶毒人數已達6仟萬人，死亡人數超過3佰萬人，其中2仟萬人在充分表現出艾滋病病兆；其中中國艾滋病人有168人，香港有422人。西藥AZT自1985年推出之后，現已不能奏效，HIV已表現出明顯的抗藥性；中藥由于受到傳統工藝的束縛，雖然理論上分析覺得有把握攻克HIV，實際上沒有一類能起作用。因此說，GGA基因工程多肽藥物的研制開發，無論從制藥工業或從治病療效來說，都具有重大的現實意義和深遠的時代意義。本世紀下半葉以來，由于生物學科的突飛猛進及生物化學、醫學、有機化學、分子生物學、細胞生物學、DNA重組技術及單克隆抗體技術等的發展和相互滲透的縱橫深入，使醫學科學步入其發展以來最令人振奮的時期；生物技術在藥物合成和新藥研究中的應用越來越廣泛；抗生素、維生素、氨基酸、激素和核苷酸等微生物轉化機理及其藥物合成中的應用，藥用酶和酶抑制劑的研制，免疫學基本原理及生物制品和單克隆抗體診斷試劑的研究，基因重組以及基因工程活性蛋白的多肽藥物的應用范圍日漸擴大，使許多疾病的治療更趨合理。但是，生物技術體系的五大方面(即基因工程、細胞工程、酶工程、發酵工程和生化反應器工程)在農業方面的開發利用雖然比較成功，在分子水平、細胞水平、組織水平與個體水平上對生命有機體進行不同層次的定向設計、創造、組建具有人類所需性狀的新物種或新品系方面雖然也比較成功，但是在制藥工業上的應用卻僅僅是開始，而且僅局限在牛生長激素、幼畜腹瀉疫苗、人胰島素、人干攏素、淋巴細胞雜交瘤技術、酶固定化技術與酶分子改進修飾技術等方面；這些方面投資大，周期長，對人員和設備要求高，不便于推廣應用。尤其是生物技術在制藥工業上的廣泛利用、推廣還是一個空白。生物技術如何以生物系統為對象，尤其是以中藥材為對象，生物反應在常溫常壓下快速連續進行，不生產任何無用多余產物，顯著節約能耗與原料，縮短生產周期，減少環境污染，開辟一條生產純度高、成本低、安全有效的生物制品或多肽藥品生產的新途徑，是當代制藥工業面臨的共同課題。更何況利用基因工程重組、克隆技術改造中藥制藥工業，至今還未見任何報導。本專利技術的目的在于提供一種利用中藥材、真菌與細菌雜交形成的新的微生物基因的質粒DNA和動植物細胞經基因工程重組、克隆的方法生產的基因工程多肽藥物。這種基因工程多肽藥物的營養指數可以達到甚至超過屹今為止所有同類藥品的營養指數，并有最佳的性能價格比。本專利技術所說的中藥材指的是中國《本草綱目》所載的中藥材、草藥、動物、植物、菌類、海藻類、礦物等為主原料，配備其它有核細胞為材料，經基因工程重組、克隆工藝精制而成的一種中藥西化生物藥品。本專利技術所說的多酶反應體系，指的是纖維素酶、真菌蛋白酶、葡萄糖異構酶和淀粉酶的固定化聚合反應體。本專利技術制備工藝原理是把培養基中中藥材細胞的有效成份，通過多酶反應體系的酵解，將大分子的纖維素、木質素降解為小分子的營養代謝物質，如多糖類、氨基酸、膽堿、纖維素等與動物肝臟或胰臟或脾臟等有核細胞的DNA(或RNA)、在載體質粒DNA的作用下進行重組，基因與載體連接的末端比例為3∶1到10∶1之間，然后進行脈沖場電泳使活性細胞增殖，然后進行克隆。最終產生基因工程多肽藥物。這種新型的技術路線和方法能夠使絕大部分的保留培養基中中草藥材的有效成份，如組方中的黃芪素保存率可達80％-88％，比傳統工藝提高4-5倍。通過基因工程處理后，藥物的分子結構起了根本改變、小分子蛋白、游離氨基酸、亞麻酸及多肽等生物活性物含量大大增多，對阻止艾滋病病毒以逆轉錄形式形成DNA，整合人細胞有顯著效果，對攻克艾滋病提供了有效的途徑。按照本專利技術的目的，專利技術人公開的，是以70-90％的中藥材，3-7％鴨髓核苷酸溶液，0.1-2.0％的有核細胞DNA或RNA提取物，0.1-1.0％質粒DNA提取液等組成，以及3-10％的酵母提取物和產酶促進劑。以上各組份含量均以重量百分比計算，上述的酵母提取物可以是啤酒醇母也可以是酵母膏。上述的產酶促進劑可以是蛋白胨、瓊脂等產酶促進劑，也可以是吐溫80。根據各種主原料的營養成份不同，治病功效的要求可以選用不同的酵母、產酶促進劑。制備本專利技術所述的基因工程多肽藥物的技術方案如下1、基因工程菌的培養將含有天然質粒的乳酸桿菌置于含氯霉素的肉湯培養基中培養過夜，離心收集的細胞懸浮于TE中，再次離心收集的細胞，重懸于由TES、CTE，蔗糖組成的溶液中，勻漿后獲得懸浮液，將懸浮液細胞裂解后，離心、收集上清，加入CsCL和溴化乙錠離心。將乳酸桿菌DNA轉化香菇菌，轉化產物鋪在含氯霉素的平板上。2、鴨髓核苷酸的制備將新鮮鴨骨頭破碎，取鴨髓，用乙酸浸泡，取溶液加入三氯乙酸進行沉淀，用吸管頭將絮狀物挑出，在75％乙酸中洗滌兩次，加入2倍7.5％濃度的醋酸氨，然后用鹽析法提純多核苷酸溶液。3、中草藥有效成分的提取將人參、生黃芪、白術、麥冬、五味子等中草藥原材料預處理，120目粉碎，加酶攪拌，固體發酵，礦泉水浸泡，離心，取上清加甘油(待用)。4、動物肝臟或胰臟、脾臟DNA的制備取動物肝臟或胰臟或脾臟進行預處理，存放在-20℃--80℃冰箱中，啟用時切下2克量進行勻漿破碎，離心，取上清液，加異戊醇，10分鐘后離心，取上清液，置于零下20℃待用。5、基因工程多肽藥物的配制取70％-90％總量的步驟3的待用物，3-7％重量的步驟2獲得的溶液，和0.1-2％步驟4的待用物混勻，加入0.1-1.0％步驟1的產物，加入0.6％-6％連接緩沖液Tris-Hcl，牛血清白蛋白，凝膠電泳，加入堿性磷酸酶處理1小時，加入0.1％-1％啤灑酵母的紅色菌落，調PH5.8，加入2％蛋白胨，2％D-葡萄糖，2％瓊脂，電泳、再加入真菌蛋白酶，檸檬酸、檸檬酸鈉、葡萄糖，礦泉水，電泳、收集產品，加50％甘油，冷凍烘干，裝膠囊。藥效分析用上述實施例制備的基因工程多肽藥物(GGA-IK)對病毒具有強烈的殺滅作用，且無抗藥性、無毒副作用。從1986年3月到1998年5月研究過程中所提供的臨床實驗參數如下(1)小鼠急性毒性實驗結果。24小時之內分別給每只小鼠灌服GGA-IK混懸液3×5000mg/kg后，7天內未見死亡。給藥后8天活殺，尸檢未見心、肝、肺等主要臟器有肉眼可見的病理變化。(2)大鼠長期毒性實驗結果。實驗大鼠給藥后的生態行為和外觀均無異常，經體重測定實驗組和給藥組均無明顯差異。給藥過程中測定動物的外周血血象及凝血時間，血液生化指標，結果表明，實驗組和給藥組均無明顯異常，無明顯不良影響。活殺解剖，未見明顯毒性損傷，胸腺增長異常活躍。結果說明GGA-IK屬無毒物質。(3)基因工程多肽是由天然中藥材通過基因工程方法制備而成的純天然制品，服用后能增加機體的免疫功能，以玫瑰花環和3H-TdR等免疫理學測定服藥前后機體的免疫功能指標，說明能促進巨噬細胞的生成，活化體內NK-殺傷細胞的活性，誘導促進IL-2的生成，改善乙肝臨床癥狀。(4)肝癌病人用本專利技術藥物前后，以酶免疫法測定病人體機T-Ea％(淋巴細胞活性)本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基因工程多肽藥物的制備方法，該方法包括下列步驟：（１）從含有天然質粒的乳酸桿菌菌株提取質粒ＤＮＡ，用該質粒ＤＮＡ轉化香菇菌，重新提取質粒ＤＮＡ；（２）取新鮮鴨髓，制備鴨髓核苷酸；（３）將中草藥原材料預處理，粉碎，加酶、發酵， 離心取上清；（４）制備動物肝臟或胰臟、脾臟ＤＮＡ；（５）將總量為７０－９０％的步驟（３）產物，３－７％重量的步驟（２）獲得的溶液，和０．１－２％重量的步驟（４）的產物混勻，加入步驟１的產物，加連接緩沖液和牛血清白蛋白進行凝膠電泳，加 堿性磷酸酶處理，加入啤酒酵母菌落，進行脈沖電泳１小時，然后加入真菌蛋白酶，待固化后再次電泳，收集產品。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：林陸山，
申請(專利權)人：林陸山，吳志誠，張園，吳志勇，梅凱，
類型：發明
國別省市：35[中國|福建]