含有免疫球蛋白的組合物，所述免疫球蛋白與預定人抗原結合的親合力常數（Ｋａ）至少為２ｘ１０↑［９］Ｍ↑［－１］，其中所述免疫球蛋白由下列成分組成： 具下列組成的人序列輕鏈：（１）含有基本上等同于由人Ｖ↓［Ｌ］基因片段和人Ｊ↓［Ｌ］片段編碼的多肽序列的輕鏈可變區，和（２）含有基本上等同于由Ｃ↓［Ｌ］基因片段編碼的多肽序列的輕鏈恒定區；和 具下列組成的人序列重鏈：（１）含有基本上等同于由人Ｖ↓［Ｈ］基因片段、或Ｄ區以及人Ｊ↓［Ｈ］片段編碼的多肽序列的重鏈可變區，和（２）含有基本上等同于由人Ｃ↓［Ｈ］基團片段編碼的恒定區。（*該技術在2016年保護過期，可自由使用*）
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及能夠生產異源抗體的轉基因非人動物、用于生產所述動物的轉基因、能夠以V-D-J重組功能性重排異源D基因的轉基因、能夠生產異源抗體的無限增殖化B細胞、用于生產多種同種型異源抗體的方法和轉基因、用于生產異源抗體的方法和轉基因(其中與種系重排的可變區序列相比，可變區序列含有體細胞突變)、生產具有人一級序列并與人抗原結合之抗體的轉基因非人動物、從所述轉基因動物B細胞制備的雜交瘤以及由所述雜交瘤表達的單克隆抗體。
技術介紹
發展單克隆抗體在人體中的體內治療和診斷應用所面臨的主要障礙是非人免疫球蛋白的內在免疫原性。例如，當給具有免疫能力的病人施用治療劑量的嚙齒類單克隆抗體時，病人產生抗嚙齒類免疫球蛋白序列的抗體；這些人抗小鼠抗體(HAMA)中和了治療抗體并會引起急性毒性。因此需要生產與特異性人抗原反應的人免疫球蛋白，所述抗原是預定的治療和/或診斷靶。但是，生產與人抗原特異性結合的人免疫球蛋白還有很多問題。目前用于生產單克隆抗體的技術涉及用抗原預接觸或引發動物(通常是大鼠或小鼠)、從所述動物中收集B細胞并產生雜交瘤克隆文庫。通過篩選具有抗原結合特異性(個體型)的雜交瘤群并篩選免疫球蛋白類型(同種型)，可以篩選出分泌所需抗體的雜交瘤克隆。但是，當將現有生產單克隆抗體的技術用于生產具有人抗原結合特異性的人抗體時，獲得生產人免疫球蛋白的B淋巴細胞則出現了嚴重的障礙，因為人通常對自身抗原不產生免疫反應。因此，現有生產能與人抗原特異性反應的人單克隆抗體的方法顯然不適當。顯然，當用非人品種作為制備雜交瘤的B細胞源時，對于生產抗真正自身抗原的單克隆抗體也有同樣的限制。構建含有功能性異源免疫球蛋白轉基因的轉基因動物是可以生產與自身抗原有反應性的抗體的一種方法。但為了表達有治療用途的抗體或獲得生產所述抗體的雜交瘤克隆，轉基因動物必須產生能夠通過B淋巴細胞發育途徑成熟的轉基因B細胞。所述成熟要求在轉基因B細胞上存在表面IgM，但有治療用途的只有不是IgM的同種型。因此，需要轉基因和含所述轉基因的動物，所述轉基因通過功能性V-D-J重排可產生重組多樣性和連接多樣性。此外，所述轉基因和轉基因動物優選包含順式作用序列，所述序列有利于從B細胞成熟所需的第一同種型轉變成有良好治療效用的同種型。已經報道了許多試驗，這些試驗利用轉染的細胞系確定Ig基因重排所需的特異性DNA序列(見Lewis and Gellert(1989)，Cell，59,585-588中的綜述)。所述報告鑒定了推測的序列并得出結論這些序列對重排所用重組酶的可接近性受轉錄調節(Yancopoulos and Alt(1985)，Cell，40,271-281)。報道認為V(D)J連接的序列是高度保守的接近回文的七聚體以及由12或23bp間隔序列分開的不太保守的富集AT的九聚體(nanomer)(Tonegawa(1983)，Nature，，302,575-581；Hesse，et al.，(1989)，Genes in Dev.，3,1053-1061)。報道說有效重組僅發生在含重組信號序列的位點之間，所述信號序列含有不同長度的間隔區。Ig基因重排，盡管在組織培養細胞中進行了研究，但在轉基因小鼠中還未得到廣泛地驗證。只有很少的報告公開描述了導入到小鼠中的重排試驗構建體。但這些試驗的結果是不確定的，在一些情況下，發生了轉基因的不完全或很少的重排。此外，抗體分子的各種生物學功能由分子的Fc部分產生，如通過Fcε與肥大細胞或嗜堿細胞相互作用、通過Fcμ或Fcγ進行補體結合，還需要通過同種型的改變使具有給定特異性的抗體產生功能多樣性。盡管已經有了帶有編碼異源抗體的一條或多條鏈的轉基因的轉基因動物，但尚未有成功地進行同種型轉換的異源轉基因的報道。不能轉換同種型的轉基因動物只能生產單一同種型異源抗體，更具體地說，只限于生產B細胞成熟所必需的同種型，如IgM和可能的IgD，因此只有有限的治療應用。因此需要異源免疫球蛋白轉基因和轉基因動物，它們可將B細胞發育所需的同種型轉換成具有治療所需特征的同種型。基于上述原因，顯然需要能夠有效生產異源抗體，例如在第二個品種中生產由第一品種的遺傳序列編碼的抗體的方法。更具體地說，本領域需要異源免疫球蛋白轉基因和轉基因動物，它們能夠進行摻入全部或部分D基因片段的功能性V-D-J基因重排，所述D基因片段是產生重組多樣性的原因。此外，本領域還需要可支持V-D-J重組和同種型轉換的轉基因和轉基因動物，以便(1)功能性B細胞可發育和(2)可生產治療上有用的異源抗體。還需要可用于制備雜交瘤的B細胞源，所述雜交瘤生產在所針對的特定靶種中有治療或診斷用途的單克隆抗體。能夠進行功能性V-D-J重組和/或能夠進行同種型轉換的異源免疫球蛋白轉基因可滿足這些需要。根據前述目的，提供了能夠生產異源抗體如人抗體的轉基因非人動物。此外，另一個目的是提供來自所述轉基因動物的能夠表達異源抗體的B細胞，其中所述B細胞是可無限增殖的，是產生特異于特定抗原的單克隆抗體的源。根據前述目的，本專利技術的另一目的是提供能夠生產所述異源單克隆抗體的雜交瘤細胞。另外，本文的又一個目的是提供異源未重排和重排的免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉基因，這些轉基因可用于生產前述非人轉基因動物。此外，本文的再一個目的是提供破壞轉基因動物中內源免疫球蛋白座位的方法。另外，本文的另一個目的是提供在前述轉基因非人動物中誘導異源抗體生產的方法。本專利技術的另一目的是提供生產免疫球蛋白可變區基因片段庫的方法，該庫可用于構建本專利技術的一種或多種轉基因。本文所討論的參考文獻僅僅是本申請申請日之前其公開的內容。本文沒有任何內容表明專利技術人不可以通過在先專利技術而將所述文獻內容的公開日期提前。專利技術綜述提供了能夠生產異源抗體，如人抗體的轉基因非人動物。所述異源抗體可以是各種同種型，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD、IgE。為了使所述轉基因非人動物產生免疫反應，需要使轉基因B細胞和前B細胞產生表面結合的免疫球蛋白，特別是IgM(或可能是IgD)同種型，以便實現B細胞發育以及抗原刺激的成熟。IgM(或IgD)表面結合免疫球蛋白只需在B細胞發育的抗原-刺激成熟期表達，然后成熟B細胞可以生產其它同種型，盡管一次只能生產單一轉換的同種型。通常，B細胞系的細胞一次只能生產單一的同種型，盡管可進行順式或反式RNA剪接，例如天然產生的μS(分泌的μ)和μM(膜結合的μ)型，但μ和δ免疫球蛋白鏈會導致一個細胞同時表達多種同種型。因此，為了產生多同種型的異源抗體，具體地說是治療上有用的IgG、IgA和IgE同種型，就需要有同種型轉換發生。所述同種型轉換可以是經典的型-轉換，或者可源于一種或多種非經典的同種型轉換機制。本專利技術提供了異源免疫球蛋白轉基因和含所述轉基因的轉基因非人動物，其中所述轉基因動物能夠通過同種型轉換生產多種同種型的異源抗體。經典的同種型轉換是通過重組而進行的，該重組過程至少與轉基因的一個轉換序列區有關。非經典的同種型轉換可通過例如人σμ和人∑μ序列之間的同源重組(δ-相關的缺失)而進行的。其它非經典轉換機制如包括轉基因間和/或染色體間重組以及其它方式也可以發生并可實現同種型轉換。所本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：尼爾斯·隆博格，羅伯特·M·凱，
申請(專利權)人：真藥物國際公司，
類型：發明
國別省市：
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