超氧化物歧化酶-4制造技術

編碼ＳＯＤ－４的分離的多核苷酸，所說多核苷酸選自如下一組： （ａ）編碼具有圖１的推導氨基酸序列的ＳＯＤ－４多肽或所說多肽的片段，類似物或衍生物的多核苷酸； （ｂ）編碼具有由ＡＴＣＣ７５７１６的ｃＤＮＡ編碼的氨基酸序列的ＳＯＤ－４多肽或所說多肽的片段，類似物或衍生物的多核苷酸。（*該技術在2014年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及新鑒定的多核苷酸，由此多核苷酸編碼的多肽，此多核苷酸和多肽的應用，以及此多核苷酸和多肽的生產。更精確地說，本專利技術的多肽為超氧化物歧化酶(SOD-4)。氧和體內諸如蛋白質，碳水化合物，脂類和核酸的生化化合物之間的反應需要很強的熱動力學驅動力。如果這種反應完成，水，二氧化碳和大量廢物將作為終產物形成，同時釋放大量能量。生物化合物的氧化是有機體能量的來源。這些反應自發進行，但由于反應屏障的原因而非常緩慢。中間代謝中的酶可以克服這些屏障，與氧的最終反應發生在線粒體，在線粒體內氧原子被四個電子還原成水而不會釋放出任何中間產物。此反應由電子傳遞鏈中的細胞色素氧化酶復合物完成，能量以ATP的形成被捕獲。但是，從氧原子到水的直接四步還原是唯一的，當氧原子自發反應或由酶催化進行時，此過程有時將被迫反應一步。一系列被稱為超氧化物基團(O2)，過氧化氫(H2O2)，和羥基基團(OH-)的有反應活性和毒性的中間代謝物將形成。其中的兩個，O2-和OH-，具有單個未成對電子，因此被稱為自由基。估計體內氧消耗的一小部分將形成有毒的還原中間產物。氧的毒性作用主要歸因于這些中間產物的活動。氧原子自身與生化化合物的反應緩慢，通常毒性反應是由產生升高的氧基團的過程起始的，這些毒性反應可直接破壞生化化合物或啟動有氧的鏈式反應。有些化合物與氧原子自發發生反應，即，這些化合物自氧化。幾乎所有的自氧化都會導致有毒氧還原中間產物的形成。腎上腺素，鄰苯三酚和幾個其它化合物的自氧化導致超氧化物自由基的形成。當離子化的基團穿過含氧的水樣溶液時，發現超氧化物基團是含量最高的基團。如此形成的有毒氧還原產物對細胞的殺滅能力具有十分重要的意義，但這些產物還可能導致周圍組織的破壞。過氧化氫總是在超氧化物通過歧化反應途徑形成時形成。大多數體內的氧化酶直接將氧還原成過氧化氫。生活在有氧環境中的有機體被迫進化出大量的保護性機制以抵抗有毒氧還原代謝物。這些保護性因子包括歧化超氧化物基團的超氧化物歧化酶(SOD)，在哺乳動物細胞和組織中SOD的數量相當穩定。這些酶中最知名的是CuZnSOD，CuZnSOD是一個含兩個銅原子和兩個鋅原子的分子量為33,000的二聚體。CuZnSOD存在于細胞質和線粒體的膜間間隙。MnSOD是一個含四個錳原子的分子量為85,000的四聚體，主要位于線粒體的基質中。直到最近，人們還認為細胞外液體中缺乏SOD活性。但是，最近U.S.專利5,248,603披露胞外液(例如，血漿，淋巴液，滑液和腦脊髓液)中存在一種叫做EC-SOD的超氧化物歧化酶。重組的人野生型CuZuSOD和其熱穩定的雙突變體(Cys-6-----Ala，Cys-111----Ser)已經在2.5A的分辨率上測定分析了其晶體結構。在一個鋅結合位點上存在一個螺旋偶極相互作用，14個殘基形成兩個或多個結構保守的側鏈以保證氫原子的結合，這些結構對活性位點結構，環的形成和Cys-111----Ser突變造成的穩定性提高看來是至關重要的。Parge，H.E.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.U.SA.，896109-13(1992)。CuZnSOD基因的突變發生在致命的神經退化性紊亂-家族性半身肌萎縮硬化的患者身上。CuZnSOD編碼區的篩選揭示外顯子1內的Ala4-Val突變是最經常發生的，在外顯子2，4和5內鑒定出了突變，但在外顯子3形成的活性位點區沒有發現突變體。因此，缺陷型CuZnSOD與運動神經元死亡有關，也有助于了解或治療家族性半身肌萎縮硬化。本專利技術的多肽，SOD-4，在結構和功能上與CuZnSOD有關。日本專利4327541披露了一種用于器官移植后免疫反應的治療藥物，含有通過基因重組獲得的人CuZnSOD的活性物質。日本專利4312533披露了一種治療大腦局部出血組合物，它包括重組的人CuZnSOD，抑制與局部出血相伴的延遲性神經壞死。日本專利4248984披露了一種在血液中比SOD具有更長半壽期的超氧化物歧化酶衍生物，因此有助于治療各種疾病。歐洲專利499621披露了一種純化重組CuZnSOD的方法和一種提高此多肽的B型同工類似物產量的方法。日本專利2156884披露了一個具有超氧化物歧化酶特性的153個氨基酸的多肽和一個編碼此多肽的DNA序列，和通過寄主細胞培養來生產DNA序列和此多肽的方法。日本專利63313581披露了一個通過SOD與含氨基或羧基基團的化合物反應形成的具有藥物活性的修飾超氧化物歧化酶。日本專利63077822披露了一個使用類似人SOD的多肽作活性物質，改善器官功能的因子。根據本專利技術的一個方面，提供了一個新的成熟多肽，即SOD-4，和SOD-4的片段，類似物和衍生物。本專利技術的多肽是人源性的。根據本專利技術的另一個方面，提供了編碼此多肽的多核苷酸(DNA或RNA)。根據本專利技術的另一個方面，提供了通過重組技術生產此多肽的方法。根據本專利技術的另一個方面，提供了此多肽或編碼此多肽的多核苷酸用作藥物的方法，例如，治療炎癥，潰瘍，心率失常，局部出血，浮腫，paraquat中毒，類風濕性關節炎和骨關節炎，降低再灌注損傷和降低血壓。根據本專利技術的另一個方面，提供了一個抗此多肽的抗體。從本文的教導中，本領域熟練技術人員應該明白本專利技術的這些和其它一些方面。以下附圖示出了本專利技術的實施方案。附圖說明圖1顯示了SOD-4基因的cDNA序列和推測的氨基酸序列。因為至少有兩個框內ATG起始密碼子，所以氨基酸序列編碼此多肽成熟形式之一。成熟多肽可能在任一ATG密碼子開始啟動。氨基酸使用標準的單字母縮寫。圖2顯示SOD-4與其它11個來源于其它生物種的胞質CuZnSOD之間的氨基酸相似性。銅鋅結合位點(用加粗字體)由6個His殘基和1個Asp殘基形成。Arg(R)殘基對指引超氧化物到活性位點是必要的。相同殘基由虛線表示，缺失由點表示。圖3顯示人SOD-4的細菌表達和純化的結果(SDS聚丙烯酰胺凝膠分離)。圖4顯示重組SOD-4在COS細胞中的表達結果(SDS聚丙烯酰胺凝膠分離)。根據本專利技術的一個方面，提供了編碼具有圖1推測氨基酸序列或由1994年3月22日保藏的ATCC 75716的克隆的cDNA編碼的成熟多肽的分離核酸(多核苷酸)。本專利技術的多核苷酸是從早期人腦cDNA文庫中分離出來。它含有編碼255個氨基酸的多肽的一個開放閱讀框架。此多肽與從Schistosoma mansoni分離出來的CuZnSOD有最高的同源性，在151個氨基酸重疊中有51％相同，72％相似。本專利技術的多核苷酸可以是RNA形式，或DNA形式，DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA，DNA可以是雙鏈或單鏈，并且如果是單鏈，則可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。編碼成熟多肽的編碼序列可以與圖1所示的編碼序列相同，或與保藏克隆的編碼序列相同，或者也可以是不同的編碼序列，該編碼序列由于遺傳密碼的豐余性或簡并性，與圖1的DNA或保藏的cDNA編碼相同的成熟多肽。編碼圖1的成熟多肽或編碼由保藏的cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸可以包括成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和另外的編碼序列如前導序列或分泌序列或蛋白原序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的另外的編碼序列)和非編碼序列如內含子或成本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：余國良，克雷格·A·羅森，克萊爾·M·弗雷澤，讓尼娜·D·戈凱恩，
申請(專利權)人：人體基因組科學有限公司，
類型：發明
國別省市：